猪病毒性腹泻有效防控——生猪产业无法回避的现实问题

猪病毒性腹泻并不是一种传染病,而是一大类感染消化道病毒病的统称,因其临床症状均导致腹泻而得来,其病源包括4种猪肠道冠状病毒和猪轮状病毒(PoRV)。猪肠道冠状病毒主要包括猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和新发的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)。

猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究

为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin处理Vero E6细胞后以SADS-CoV感染,于感染后不同时间收获细胞,通过western blot和病毒滴度(TCID_(50))测定检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与仅感染病毒的对照组相比,采用3-MA处理Vero E6细胞后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)均显著降低(P<0.05),而采用Rapamycin处理后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)则均显著升高(P<0.05)。针对ATG5基因设计3条特异性的ATG5 si RNA(siATG5-1/2/3),将干扰效率较好的siATG5-1转染Vero E6细胞后再以SADS-CoV感染,24 h后检测病毒滴度并利用western blot检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与未转染siATG5的3组阴性细胞相比,转染细胞中SADS-CoV N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著降低(P<0.05)。本研究首次表明SADS-CoV感染可以诱导宿主细胞自噬并促进病毒的复制,该结果为深入研究SADS-CoV感染与其致病机理以及防控该病毒的感染奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6核仁蛋白Fibrillarin的亚细胞定位分析

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与Vero E6细胞核仁fibrillarin蛋白的亚细胞定位的特征。本实验参照GenBank中人细胞fibrillarin基因(M59849.1)序列,设计并合成特异性引物,利用RT-PCR方法扩增了Vero E6细胞的fibrillarin基因,并将其克隆于真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed-Fib。将pDsRed-Fib与本实验室构建的含有PEDV N基因的重组质粒pAcGFP-N,共转染Vero E6细胞。Western blot结果表明fibrillarin及N融合蛋白在转染的Vero E6细胞中均获得表达;利用共聚焦显微镜观察显示在共转染VeroE6细胞中PEDV N蛋白与Vero E6细胞核仁中的fibrillarin发生共定位。该结果为进一步研究PEDV和核仁蛋白相互作用奠定基础。

开放性喉外伤急诊救治及临床分析

目的:探讨开放性喉外伤的急诊救治、手术处理方法。方法:回顾性分析开放性喉外伤28例患者的临床资料。结果:28例全部急诊手术治疗,1例患者在抢救中合并心肺功能衰竭死亡,其余27例患者临床治愈后随访6个月以上。27例患者中有25例患者术后发音恢复正常,其中有2例术后发生咽瘘,1例术后发生气管食管瘘,经进一步处理瘘道愈合,无声音嘶哑。另有2例患者术后发生喉狭窄,再次手术后喉狭窄治愈,但声音仍嘶哑。结论:在开放性喉外伤的急诊救治过程中,应尽量抢救生命,最大限度保留、恢复喉功能和防止并发症的发生。

猪流行性腹泻病毒蛋白对Vero E6核蛋白B23.1的影响

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)核蛋白N对Vero E6细胞核仁蛋白B23.1的影响,将本实验室构建的DsRed-N1/B23.1重组质粒转染Vero E6细胞,转染6h后接种PEDV,分别在转染后12、18h和24h三个时间点,进行病毒感染细胞的间接免疫试验,同时设未感染对照组,而后利用激光共聚焦显微镜分析感染和转染细胞中B23.1蛋白的变化。结果表明,PEDV N蛋白与Vero E6核蛋白B23.1有共定位特征,在PEDV感染Vero E6细胞12h后,B23.1蛋白开始发生变化,随着时间的延长逐渐碎裂、分散。这个结果提示,病毒可能通过破坏核仁的结构和核仁蛋白的功能,进而为病毒的复制提供便利。

鼻内镜下电凝止血术治疗难治性鼻出血临床观察

目的总结鼻内镜下双极电凝止血术治疗反复鼻出血的临床经验。方法回顾性分析2004年9月～2009年9月我科采用经鼻内镜引导下双极电凝治疗50例难治性鼻出血的临床资料。结果本组50例难治性鼻出血患者均在鼻内镜下找到出血部位,以出院后1月内未再次出血作为治愈标准,1次性治愈48例,2次治愈2例,总有效率100%。结论鼻内镜下治疗难治性鼻出血具有视野清晰、出血部位明确、止血迅速、疗效确切、术后反应轻等优点,提高了鼻出血治疗的效果和质量。

开放性喉外伤急诊喉重建手术及临床分析

目的探讨开放性喉外伤的准确诊断与急诊处理方法。方法回顾性分析开放性喉外伤急诊患者17例的临床诊疗资料,总结其临床特点及诊疗经验。结果 17例患者均采用了急诊重建手术。术后12例发音恢复正常;2例发生术后咽瘘,1例发生术后气管食管瘘,经进一步处理后瘘道均愈合,无声音嘶哑;1例术后发生喉狭窄,再次手术后喉狭窄治愈,单遗留术后声音嘶哑;1例患者因伤势过重而死亡。结论在开放性喉外伤的急诊期即应尽抢救,最大限度保留或恢复喉功能,防止并发症。

Vero细胞nucleolin和fibrillarin基因的克隆及序列分析

为克隆及分析Vero细胞的nucleolin和fibrillarin基因,本研究根据人类的相关基因设计两对引物,从Vero E6细胞中扩增nucleolin和fibrillarin基因。测序结果显示nucleolin基因序列长度为2 139 bp,编码712个氨基酸;fibrillarin基因序列长度为969 bp,编码322个氨基酸。与GenBank中登录的人类相应序列相似性高达97%,处于同一进化分支,表明该基因具有种属特异性并且保守性很高;同时利用软件对nucleolin和fibrillarin预测蛋白进行了生物信息学分析,从而为研究冠状病毒核蛋白与核仁蛋白相互作用奠定了基础。

CO_2激光显微手术与喉内镜下常规手术在声带息肉切除术中的疗效差异分析

目的探索激光显微手术与喉内镜下常规手术在声带息肉切除术中的疗效差异。方法方便收集该院2015年2月—2018年2月声带息肉患者62例。随机分为研究组和对照组,各31例。研究组采用CO_2激光显微手术,对照组采用喉内镜下常规手术。然后对两组患者进行电子喉镜、频闪喉镜检查。分析两组患者术前、术后1周、术后1个月和3个月的VHI主观评分、GRBAS、客观嗓音。结果术后1周研究组的嘶哑度是(2.1±0.6),术后1周对照组的嘶哑度是(1.6±0.8)。术后1周对照组的嘶哑度低于研究组,差异有统计学意义(t=2.784,P<0.05);术后1个月研究组的基频微扰百分比、基频扰动商、振幅微扰百分比分别是(3.2±0.6)%、(1.3±0.5)%、(3.3±0.4)%。术后1个月对照组的基频微扰百分比、基频扰动商、振幅微扰百分比分别是(3.2±0.6)%、(1.3±0.6)%、(3.6±0.9)%。研究组和对照组患者术后1个月的基频微扰百分比、基频扰动商、振幅微扰百分比差异无统计学意义(t=0.000,P>0.05;t=0.000,P>0.05;t=1.696,P>0.05)。结论 CO_2激光喉显微手术治疗声带息肉疗效优于喉内镜下常规手术。

抗生素耳浴联合臭氧治疗对慢性化脓性中耳炎患者听力恢复及治疗后复发率的影响

目的探讨抗生素耳浴联合臭氧治疗对慢性化脓性中耳炎患者听力恢复及治疗后复发率的影响。方法选取2015年6月~2016年8月收入耳鼻喉科的慢性化脓性中耳炎患者100例为研究对象,随机分为研究组和对照组,每组50例,对照组采用氧氟沙星滴耳液进行耳浴,研究组在对照组基础上给予臭氧治疗,比较两组患者的治疗效果,听力恢复情况及复发情况。结果研究组的总有效率显著高于对照组,差异具有统计学意义(χ~2=13.02,P=0.005)。治疗后,两组患者的细菌培养阳性率显著降低,且研究组显著低于对照组,差异具有统计学意义(χ~2=6.49,P=0.000)。研究组患者的骨导听阈和气导听阈降低值均显著大于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论氧氟沙星耳浴联合臭氧治疗慢性化脓性中耳炎具有良好的临床疗效,可以显著改善患者的听力恢复情况。

鼻内镜外科技术在治疗鼻-鼻窦内翻性乳头状瘤临床应用

采用鼻内镜外科治疗鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤25例,观察其临床疗效。随访12～24个月,25例患者中治愈21例(84%),复发4例(16%),其中1例位于额隐窝、3例位于后组筛窦,鼻内镜下将复发肿瘤组织全部切除,随访跟踪1年无复发。认为鼻内镜手术治疗鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤是一种有效的方法,对肿瘤广泛侵犯上颌窦者应联合柯陆径路效果更佳。

国内首株猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)的分离鉴定

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新出现的猪冠状病毒,于2012年首次在香港的猪群中发现。2014年2月美国在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV,随后,韩国和我国大陆也从腹泻猪的临床样品中检测到PDCoV。目前,只有美国成功分离到2株PDCoV。为分离鉴定PDCoV,本研究将PDCoV阳性样品无菌处理后接种猪肾细胞(LLC-PK)并连续传代培养。通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光和基因序列测定对细胞培养物进行鉴定。结果表明我们成功分离到国内首株PDCoV并将其命名为NH株。M基因的系统发育分析表明NH株与中国、美国及韩国的PDCoV亲源关系较近。本研究为进一步研究PDCoV的致病性和致病机制奠定了基础。

2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析

为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本研究设计合成2对扩增S1基因的引物,利用套式RT-PCR方法,对2011年分离的17个PEDV S1基因进行扩增、克隆和序列测定;并将其进行比对和遗传演化分析。结果表明:17个PEDV S1基因序列与参考病毒株S1基因核苷酸序列同源性为90.54%～99.96%,与经典病毒株CV777相比,其中有6个S1基因在453 bp～454 bp处存在3个核苷酸的缺失;一个在453 bp～454 bp处缺失6个核苷酸;其它10个S1基因在173 bp～186 bp之间存在12个核苷酸的插入,413 bp～417 bp之间有3个核苷酸的插入,467 bp～468 bp处缺失6个核苷酸,插入和缺失位点与韩国病毒株KNU-0901、KNU-0905、KNU-0801相似。S1基因系统进化树分析表明,PEDV S1基因分为3群,其中7个S1基因属于PEDVⅠ群,另外10个属于PEDVⅢ群。

2011年～2012年G9型猪轮状病毒流行病学调查及VP7基因遗传进化分析

为分析G9型猪轮状病毒(RV)的遗传变异情况,本研究根据GenBank中VP7序列设计合成一对扩增VP7基因的引物,采用PCR方法对2011年～2012年分离的部分RV VP7基因进行扩增、克隆和序列测定,并进行比对和遗传进化分析。结果表明:531份病料中RV阳性份数为39,阳性率为7.34%;而在检测的121个猪场中,共有23个猪场显示阳性,猪场阳性率为19%。VP7基因全长1 062 bp,含有一个982 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸。与参考病毒株VP7全长基因核苷酸比较,同源性为91.5%～99.3%。在31 nt、56 nt、75 nt、82 nt、191 nt、215 nt等位置均存在点突变,无插入和缺失。核苷酸系统发育进化树表明:黑龙江省哈尔滨市、桦南、绥化,辽宁省大连市、内蒙古自治区采集病料样品的基因间差异较小,与采集自中国广西、浙江、贵州、北京的病料样品基因相比差异性较大,这表明VP7基因存在地域差异。

2012年猪嵴病毒流行病学调查及3D基因的遗传变异分析

为了解猪嵴病毒(PKV)的流行及变异情况,本研究根据PKV的3D基因保守区域核苷酸序列设计一对特异性引物,并利用RT-PCR方法对2012年来自24个省市84个猪场的病料样品共计236份进行3D基因的检测。结果显示:在236份病料中,共有63份为PKV阳性,阳性率为36.69%;而在检测的84个猪场中,共有36个猪场显示PKV阳性,猪场阳性率为42.85%。此外,对2012年分离的9个PKV部分3D基因进行测序分析,并与GenBank中登录的人、牛、猪以及鼠等嵴病毒株相关序列进行遗传变异分析。结果表明9个PKV 3D基因与国内外其他PKV株无论是在核苷酸水平上还是在氨基端水平上均具有较高的同源性,表明PKV的3D基因具有较高的保守性,可以作为病原检测的靶基因。

猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗M蛋白单克隆抗体(MAb),本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BALB/c小鼠;以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb。MAb亚类鉴定为IgG2b型,轻链为κ链,杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1∶3000和1∶2×105。Westernblot试验表明该MAb能够识别重组及天然的PEDVM蛋白。间接免疫荧光试验表明该MAb能够与PEDV感染的VeroE6细胞产生特异性免疫荧光。

关于富裕家庭少儿体质健康与生长发育状况的研究

首次报导了我国富裕家庭的少儿体质健康与生长发育的现状与差距。指出经济条件好的富家子女在生长发育指标上呈优良态势,其中身高,体重、胸围三项指标的均值,超过全国城市同龄组水平。但血红蛋白总体水平偏低,贫血比例较高,鸡胸、漏斗胸也有一定数量,以男孩为最。

猪轮状病毒Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/G9P[23]株的分离与鉴定

A群轮状病毒(GAR)是引起人类和多种动物腹泻的主要病原体,病原的分离与鉴定是轮状病毒(RV)流行病学、病原学等研究的基础。本研究采用接种MA104细胞的方法,从内蒙古某猪场患病猪腹泻粪便中分离一株病毒,经3次蚀斑克隆纯化后,采用电镜观察、PCR鉴定和序列测定进行分析,结果表明该分离株为猪轮状病毒(PoRV)。致病性试验表明该分离株能够引起仔猪急性腹泻,RT-PCR扩增其VP4、VP6和VP7的基因节段并进行序列测定,按照A群RV的最新分类方法,确定该分离株的VP6、VP7和VP4基因型分别为I5型、G9型和P[23]型。因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/Q9P[23]。