胶体金免疫层析技术在动物源性食品中的应用

胶体金标记免疫层析技术作为一种新型的免疫学快速诊断和检测技术,不仅具有敏感、特异、便捷、快速等特点,而且适合基层和现场使用。目前,该技术已应用在动物源性食品安全与质量控制方面。文章综述了该技术的基本原理,并且着重介绍了免疫胶体金技术在动物源性食品的应用现状和遇到的问题及发展前景。

O型口蹄疫抗体金标试纸盒检测免疫动物抗体效价与攻毒保护关系

本研究目的在于用O型口蹄疫金标试纸条研究免疫动物抗体效价与攻毒保护之间的对应关系以及免疫牛抗体消长规律。用金标试纸条检测了口蹄疫O型疫苗质量标准规定的牛、羊和猪免疫和攻毒血清抗体效价及不同免疫程序的牛血清效价。结果显示,当牛、猪和羊免疫血清稀释≥1∶8时,试纸条是阳性结果,表示有99%的被免疫动物属于抗体水平保护范围;被检测血清稀释≤1∶2时,是阴性结果,表示被免疫动物抗体水平属于不保护范围;血清稀释1∶2～1∶8时,是阳性结果,表示有50%的被免疫动物属于抗体水平保护范围。牛在首次免疫8周后加强免疫可以获得良好的保护率和保护时间。通过本试验确定了金标试纸条检测免疫动物抗体效价与攻毒保护之间的关系及牛加强免疫最佳的时间。

猪流行性腹泻病毒HB2015分离株N基因表达及单克隆抗体的制备

根据已经发表的猪流行性腹泻病毒N基因序列(GenBank:KX016034.1),设计1对特异性引物(上、下游分别插入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点),通过RT-PCR技术扩增N基因,在测序鉴定正确后经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切,将其克隆至原核表达载体pET-32a上,获得重组表达质粒pET32a-N。表达的蛋白质经纯化后进行Western blotting鉴定分析。以表达的PEDV-N蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获2株PEDV-N特异性单克隆抗体。对获得的单抗进行Western blotting鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)分析,结果显示2株单抗均能与PEDV-N蛋白特异性结合和识别。以上结果表明PEDV-N蛋白在大肠杆菌中成功表达,且成功制备了2株具有生物学活性的特异单抗,为建立PEDV金标试纸诊断方法奠定了基础。

弓形虫棒状蛋白2研究进展

棒状蛋白2(ROP2)为弓形虫生活史各期均能分泌的抗原,具有高度的保守性和免疫反应性.综述了近年来关于ROP2分子生物学特征、免疫特性、疫苗的研究进展.

弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析

应用PCR法从弓形虫QHO株速殖子基因组DNA中扩增ROP2的基因片断,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经酶切及PCR鉴定后进行测序,并进行序列分析.结果表明,自然弱毒株的开放阅读框架(ORF)与ROP2基因已知序列(Z36906)的ORF具有97%的同源性,氨基酸序列具有95%的同源性.

A型塞内卡病毒HBWH/1/2018株的分离鉴定及全基因组序列测定

为了鉴定湖北省某猪场水疱性疾病的病原,本研究采用RT-PCR、细胞分离培养、间接免疫荧光检测、电镜观察、病毒基因序列测定及分子进化分析的方法对湖北省某猪场采集的具有水疱样病变的猪水疱皮样品进行了病毒的分离和鉴定及全基因组序列的测定。结果表明:成功分离到1株A型塞内卡病毒(SVA),命名为HBWH/1/2018株。该毒株接种BHK-21细胞培养能够引起明显的致细胞病变效应;免疫荧光试验结果为阳性;病毒滴度为10^(9.35) TCID_(50)/0.1mL;该毒株基因组全长7281 bp(不包括Poly A),开放阅读框为6546 bp,编码2181个氨基酸;VP1核苷酸序列的遗传进化分析表明HBWH/1/2018株与HN01/2017株亲缘关系最近(相似性高达99.4%),而与SVA原型毒株SVV-001株的亲缘关系最远(相似性为91.3%)。本研究不仅丰富了SVA的分子流行病学数据,也为进一步研究SVA的致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础。

动物抗菌肽新型饲料添加剂的研究进展

抗菌肽是一类具有抗微生物活性的小分子多肽，具有相对分子质量小、抗菌谱广等特点，具有广谱抗菌活性和抗病毒、真菌、寄生虫及肿瘤等生物活性，且不易产生抗药性，有良好的应用前景。本文对抗菌肽的结构特点、生物活性、作用机理及在饲料中的应用现状进行了综述，并指出在开发研究抗菌肽中存在的问题，对其发展作了展望。

微生物添加剂的研究进展

微生物添加剂作为无毒、无污染生物制品类饲料添加剂，在调节动物机体微生态平衡、预防疾病、提高饲料转化率、促进动物健康和保护生态环境等方面有着其它抗生素类添加剂不可替代的作用，而且随着对其作用机理研究的深入，应用效果的进一步凸显，应用也越来越广泛。本文对微生物添加剂的概念、种类、国内外研究和应用概况及应用前景进行了综述。

口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条诊断方法的建立

为了兽医基层工作人员能够快速诊断口蹄疫病原,与其他传染病做鉴别诊断,有必要建立一种快速、简便区分它们的胶体金免疫层析方法。本试验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。将纯化的Asia 1/China/05流行毒株12S偶联抗原的兔抗体制备免疫胶体金,喷免疫胶体金于玻璃纤维制成金标垫。将纯化A/AF72流行株12S偶联抗原的兔抗体和适量O/China/99流行毒株12S偶联抗原的兔抗体混合固定于硝酸纤维素膜上作为检测带。将羊抗兔抗体固定在硝酸纤维素膜的不同区域作为质控带,并组装成口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条。利用其对阴性参考样品、各型阳性参考样品、已知背景的田间样品进行检测。灵敏度试验结果显示:建立的试纸条方法敏感性高、可检测到病毒最低含量为0.98×104 LD50;特异性试验显示:在检测与口蹄疫临床症状相似病原———猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)抗原时无交叉反应;重复性试验显示:不同批次间、同一批次内检测结果完全一致;符合性试验显示:检测国家口蹄疫参考实验室已确定口蹄疫病毒血清型的样品90份,阳性符合率、阴性符合率分别为96.70%、100%。本试验研发的口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条具有很好的灵敏度、特异性、重复性和符合性,适合国内流行的口蹄疫病原的鉴别诊断。

O型口蹄疫抗体金标检测试纸条判定标准的确立

本试验旨在迅速、准确检测口蹄疫阴性血清和阳性血清,确立O型口蹄疫抗体金标检测试纸条的判定标准。通过3批次O型口蹄疫抗体金标检测试纸条,对180份猪、牛、羊口蹄疫阴性血清,197份猪、牛O型口蹄疫弱阳性血清,317份猪、牛、羊O型口蹄疫阳性血清,223份牛Asia 1、A型口蹄疫阳性血清,600份田间血清样品进行检测,同时用O型口蹄疫液相阻断ELISA和O型口蹄疫正向间接血凝2种方法检测相同的血清样品。对3种方法检测的结果进行分析,并且将试纸条的检测线和质控线的显色情况与O型口蹄疫液相阻断ELISA的抗体滴度相比较。确立了试纸条的诊断标准:试纸条抗体滴度1∶2-为口蹄疫抗体阴性;试纸条抗体滴度1∶8+为O型口蹄疫阳性血清。根据试纸条的显色结果与液相阻断ELISA的结果的关系,绘制了比色卡。试纸条的判定标准检测血清结果与液相阻断ELISA和正向间接血凝结果分别进行统计学分析,试纸条与液相阻断ELISA和正向间接血凝相关性分别为y=1.142x+0.7421,y=1.1845x+0.8623;相关系数(r)分别为0.9221和0.9033。结果显示,O型口蹄疫抗体金标检测试纸条的判定标准的确立和比色卡的绘制,实现半定量分析,更加迅速、准确,适于实验室、基层兽医站和养殖场使用。

口蹄疫O、Asia 1分型彩色胶乳试纸条诊断方法的建立

为建立一种快速、简便、直观的口蹄疫O、Asia 1分型彩色胶乳免疫层析的方法,作者选择2种不同颜色的单分散胶乳,将纯化的Asia 1/China/05流行毒株兔抗体制备蓝色免疫胶乳;将纯化的O/China/99流行毒株兔抗体制备红色免疫胶乳。将2种免疫胶乳分别喷涂于不同玻璃纤维上,晾干叠加制成彩色胶乳反应垫。再分别将纯化的Asia 1/YN/BSh/58/B和AV99(L)标准毒株的豚鼠抗体固定于同一硝酸纤维素膜的不同区域上作为2条检测带。最后组装成口蹄疫O、Asia 1分型彩色胶乳试纸条。通过对阳性参考样品的检测,结果显示试纸条有很好的灵敏度,可检测到病毒含量为3.90×104 LD50;在检测与口蹄疫临床症状相似病原,如猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)抗原时无交叉反应,特异性好;不同批次间、同一批次内的试纸条,在检测阴、阳性参考样品时,结果完全一致,说明试纸条重复性好;试纸条对检测已知血清型的74份田间样品的符合性试验中,O型、Asia 1型样品的阳性符合率分别为95.24%、96.30%,阴性样品符合率为100%。本试验研发的口蹄疫O、Asia 1分型彩色胶乳试纸条具有很好的灵敏度、特异性、重复性和符合性,而且可以通过不同颜色进行定型检测,适合国内流行的口蹄疫病原型别的分型检测。

口蹄疫最新流行动态及防控

一、口蹄疫流行情况口蹄疫(FMD),由口蹄疫病毒引起的,偶蹄动物发生的急性、热性、高度接触性和可快速远距离传播的传染病。感染动物种类多、传播速度快、传染性极强、引起重要经济畜种的经济损失巨大,是目前国际公认的对畜牧业危害(最大)的动物传染病.

两种方法制备胶体金及其免疫标记的比较研究

为寻找-种适合口蹄疫Asia I抗体标记的胶体金，本研究采用柠檬酸三钠和柠檬酸三钠－鞣酸法分别还原氯金酸溶液，制备纳米胶体金，并分别对制得的胶体金粒子大小、粒径分布情况、稳定性及微观形貌进行了分析，同时进行口蹄疫抗体标记。结果显示，柠檬酸三钠-鞣酸法制备纳米胶体金适合口蹄疫AsiaI抗体的标记，柠檬酸三钠－鞣酸法制备胶体金较稳定．标记的试纸条灵敏度耍高于柠檬酸三钠法。

小反刍兽疫N5蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种适用于PPRVN蛋白抗体的间接ELISA检测方法,应用于PPR防疫.【方法】根据GenBank中登录小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列进行人工合成,设计1对特异引物对N5基因扩增,经测序分析后将N5基因片段和原核表达载体pET-32a(+)相连接,成功构建pET-32a-N5质粒.将pET-32a-N5转化于TransB(DE3)原核表达感受态细胞后用IPTG诱导表达获得重组蛋白,经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,重组蛋白分析具有良好的反应原性.【结果】利用原核表达纯化的PPRV N重组蛋白作为包被抗原,初步建立了一种能够检测针对PPRV N蛋白抗体的间接ELISA方法.用建立的方法对112山羊份血清进行了抗体检测,该方法与竞争ELISA试剂盒对比,临床符合率94.8%.【结论】该方法具有较好的敏感性、重复性和特异性.

小反刍兽疫病毒N基因部分片段克隆表达及鉴定

根据GenBank中登录小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列进行人工合成,在此基础上设计2对特异引物分别对N1、N5基因扩增和对N1和N5基因进行搭桥PCR连接,经测序分析后将N1-N5基因片段和原核表达载体pET-32a(+)相连接,构建pET-32a-N1-N5质粒。将pET-32a-N1-N5转化于TransB(DE3)原核表达感受态细胞后用IPTG诱导表达,将纯化重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果表明,所表达蛋白以可溶性形式表达并具有能与PPRV阳性标准血清发生特异性反应,为建立快速检测小反当兽疫病毒抗体水平诊断方法奠定基础。

稳定表达T_7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系的建立

根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。

山羊痘病毒P32基因的克隆及毕赤酵母中的表达

将人工优化合成的山羊痘病毒P32基因和表达载体p PIC9K同时双酶切后相连,构建p PIC9K-IL-2重组表达载体。将线性化的载体p PIC9K-P32电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,经G418抗性梯度筛选,获得多拷贝重组菌株,甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot。SDS-PAGE电泳显示出相对分子质量约为30 k Da目的蛋白表达条带,Western blot分析表明表达的蛋白具有反应原性。本研究成功构建载体p PIC9K-P32,并且P32基因已整合到酵母基因组中,为亚单位疫苗和鉴别诊断试剂奠定了基础。

中草药饲料添加剂对动物生产性能的影响

研究表明，中草药饲料添加剂能够改善动物生产性能、增强机体免疫能力、具有抗菌抗病毒作用和无抗药性等优点。本文就中草药饲料添加剂对动物生产性能的影响进行了综述。

pPIC9K-IL-2重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

根据Ovis aries interleukin(IL-2)序列设计1对引物,用PCR法扩增的目的基因进行克隆,将测序正确的IL-2基因片段和表达载体pPIC9K同时双酶切后相连,构建pPIC9K-IL-2重组表达载体.将线性化的载体pPIC9K-IL-2电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,用G418(4g/L)筛选到多拷贝菌株,进行不同条件下甲醇诱导表达.结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量约为18ku目的蛋白表达条带,本研究成功构建了高效表达重组羊IL-2毕赤酵母菌株,为新型细胞因子佐剂的研发奠定了基础.

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及抗原性研究

本试验旨在分析猪瘟病毒E2蛋白的免疫反应,应用RT-PCR方法扩增了编码猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株C株囊膜糖蛋白E2基因主要编码区,并定向克隆到表达载体pET-30a-c(+)中,获得重组表达载体pET30a-E2,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blottin分析结果表明,E2基因获得高效融合表达,且具有免疫反应活性。本试验为建立E2抗原的检测试剂盒奠定基础。