苯并[a]芘对神经胶质细胞中胰岛素降解酶与脑啡肽酶表达的影响

目的:探讨苯并[a]芘[benzo(a)pyrene,Ba P]对神经胶质细胞中具有β-淀粉体(β-amyloid,Aβ)清除作用的胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)及脑啡肽酶(neprilysin,NEP)表达的影响。方法:制备新生SD大鼠原代神经胶质细胞混合培养体系,接受不同浓度的Ba P、Aβ1-42寡聚体、Aβ1-42纤维体单独或联合处理24 h后,采用细胞增殖-毒性检测试剂盒测定细胞存活率。随机分为对照组、Ba P(2.00μmol/L)组、Aβ1-42(20.00 mg/L)寡聚体组、Ba P+Aβ1-42寡聚体组、Aβ1-42(20.00 mg/L)纤维体组、Ba P+Aβ1-42纤维体组,其中Ba P均为预处理12 h后再与不同聚集状态的Aβ1-42共同作用。进一步采用实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹技术检测体系中IDE、NEP的mRNA和蛋白表达水平。结果:20.00μmol/L及以下浓度的Ba P处理,20.00、40.00 mg/L的Aβ1-42寡聚体或Aβ1-42纤维体单独处理,Ba P与Aβ1-42寡聚体或Ba P与Aβ1-42纤维体联合处理对神经胶质细胞的存活率均无明显影响。与对照组相比,Ba P单独处理组中IDE、NEP的mRNA和蛋白水平均未明显改变;而Aβ1-42寡聚体单独作用可明显上调IDE的mRNA及蛋白水平(P<0.05),同时Ba P预处理可显著抑制Aβ1-42寡聚体作用引起的IDE表达水平上调(P<0.05);另一方面,Aβ1-42纤维体在单独处理或有Ba P预处理情况下,IDE、NEP的mRNA和蛋白水平均未发生明显改变。结论:在对细胞存活率无明显影响的前提下,Ba P预处理显著抑制了Aβ寡聚体作用后的IDE表达水平上调,提示苯并[a]芘可能干扰Aβ寡聚体降解途径导致Aβ增多聚集,进而可能促进认知功能降低及阿尔兹海默病的形成。

苯并[a]芘对脑内多巴胺能神经元和α-突触核蛋白的影响及其机制

目的:分析苯并[a]芘[benzo(a)pyrene,BaP]暴露对帕金森病病理特征多巴胺能神经元和α-突触核蛋白表达的影响,并探讨可能的机制。方法:8月龄人源SNCA转基因小鼠随机分为BaP染毒组和对照组,分别腹腔注射1.0 mg/kg体质量的BaP和玉米油溶剂,连续注射60 d。通过转轮实验观察小鼠运动功能障碍状况,通过免疫组织化学与免疫蛋白印迹实验观察BaP对多巴胺能神经元和α-突触核蛋白的影响,采用实时荧光定量PCR法检测相关mRNA的表达。研究中涉及的基因主要与神经递质转运蛋白、神经递质受体、细胞自噬和α-突触核蛋白聚集与降解相关。结果:BaP染毒后,转轮实验中小鼠运动时间显著降低(P<0.05),小鼠黑质多巴胺能神经元明显减少,为对照组的62%(P<0.05),中脑α-突触核蛋白表达增多,为对照组的1.36倍(P<0.05)。BaP染毒后,小鼠中脑14种mRNA表达显著下调(P均<0.05),主要涉及α-突触核蛋白降解与细胞自噬、神经元转运体、神经递质受体等功能;而Synphilin-1表达显著上调(P<0.01),与α-突触核蛋白合成有关。结论:BaP暴露抑制神经递质受体、多巴胺转运体蛋白功能和细胞自噬作用,阻碍α-突触核蛋白降解,从而诱导黑质多巴胺能神经元变性死亡和α-syn聚集体形成,增加帕金森病发病风险。

模拟肽Gap27抑制缝隙连接蛋白43在帕金森病小鼠模型中的作用

目的:探索在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)小鼠模型中,应用缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)选择性抑制剂模拟肽Gap27能否改善多巴胺神经元死亡以及对Cx43表达的影响。方法:将18只C57BL/6小鼠随机分为对照组、6-OHDA组与6-OHDA+Gap27组,每组6只,进行双侧黑质脑立体定位注射。对照组注射抗坏血酸盐溶液,6-OHDA组注射6-OHDA溶液,6-OHDA+Gap27组注射6-OHDA和Gap27混合溶液,用免疫组织化学法对多巴胺神经元标志物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)染色检测多巴胺神经元数量,实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测Cx43信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)表达,免疫荧光染色检测Cx43蛋白分布,Western blot法检测小鼠中脑Cx43蛋白及Cx43的第368位点丝氨酸磷酸化(Cx43 phosphorylation at serine 368,Cx43-ps368)蛋白含量。结果:注射6-OHDA后,小鼠出现黑质多巴胺神经元大量死亡,6-OHDA组TH阳性神经元数量降为对照组的27.7%±0.02%(P<0.01),模拟肽Gap27的使用减少了多巴胺神经元死亡数量,6-OHDA+Gap27组TH阳性神经元数量为6-OHDA组的(1.64±0.16)倍(P<0.05);此外,6-OHDA引起Cx43蛋白含量增加,Cx43-ps368蛋白含量降低。Gap27减弱了6-OHDA引起的Cx43蛋白与Cx43-ps368蛋白含量变化,6-OHDA组中脑总Cx43蛋白含量为6-OHDA+Gap27组的(1.44±0.07)倍(P<0.05),为对照组的(1.68±0.07)倍(P<0.01),且6-OHDA组Cx43-ps368蛋白含量及占总Cx43蛋白比例显著低于6-OHDA+Gap27组(P<0.05)。结论:模拟肽Gap27在6-OHDA诱导的小鼠模型中可减少黑质多巴胺神经元死亡从而发挥神经保护作用,6-OHDA引起的Cx43蛋白过表达对多巴胺神经元可能存在神经毒性,而降低Cx43蛋白水平及维持Cx43-ps368蛋白水平可能是Gap27发挥保护作用的机制。

氧化石墨烯片层对小胶质细胞神经免疫效应的调控

[背景]氧化石墨烯(GO)广泛应用于神经生物学领域。近年来研究表明,GO能够参与神经系统的调节过程,但关于其神经免疫效应调控具体机制尚无相关报道。[目的]探究GO在脂多糖(LPS)和白细胞介素4(IL-4)诱导小胶质细胞M1经典活化表型与M2选择活化表型转化中的神经调控作用。[方法]在GO基底培养基和对照培养基上对BV2细胞进行培养,分别加入20μg·L^-1 LPS或IL-4诱导BV2细胞表型转化,分组为空白对照组、GO对照组、空白-LPS组、空白-IL-4组、GO-LPS组和GO-IL-4组。比较24 h后培养上清中的细胞数量。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和流式细胞术分别检测BV2细胞表面M1表型标志物[如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、细胞因子CD86]以及M2表型标志物[如重组人精氨酸酶1(Arg1)、白细胞介素-10(IL-10)、细胞因子CD206]表达量的变化,同时使用分光光度法检测培养上清中一氧化氮(NO)的含量。[结果]与空白对照组相比,GO处理后的BV2细胞细胞计数降低(218.13±8.77和175.63±8.24,P <0.01)。相比于空白-LPS组,GO-LPS组BV2细胞上M1表型标志物TNF-α、iNOS的mRNA相对表达量(8.16±0.26和5.35±0.42;45.64±2.03和30.39±1.84)以及CD86阳性细胞率[(14.65±0.85)%和(10.29±0.46)%]降低,并且培养上清中NO的含量[(19.62±1.07)μmol·L^-1和(8.37±1.25)μmol·L^-1]降低,M2表型标志物IL-10的mRNA相对表达量升高(1.63±0.09和2.09±0.15)(P <0.05)。与空白-IL-4组相比,GO-IL-4组M1表型标志物iNOS的mRNA相对表达量增加(0.41±0.03和1.05±0.07),M2表型标志物Arg1以及IL-10的mRNA相对表达量下降(201.63±12.31和4.74±0.38;2.63±0.14和0.71±0.13),CD206的阳性细胞率和平均荧光强度下降[(17.01±1.03)%和(3.66±0.41)%;8 893.2±347.62和1 299.9±159.67](P <0.01)。[结论]GO抑制BV2小胶质细胞生长,并对LPS和IL-4诱导下的神经免疫效应所引起的BV2小胶质细胞向M1和M2表型的转化起到抑制作用。