CD155依赖m^(6)A修饰调控宫颈癌细胞的恶性行为

目的:探究CD155在宫颈癌中的作用和依赖m^(6)A修饰的调控机制。方法:应用数据库预测宫颈癌细胞中CD155(PVR)的表达情况,CD155对患者预后的影响,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定宫颈癌细胞HeLa和宫颈永生细胞S12中CD155的表达水平。分别运用MTT、平板克隆、迁移侵袭等实验评估CD155对宫颈癌细胞HeLa生长、增殖、迁移和侵袭的影响。应用Western印迹法测定E-钙黏蛋白(E-cad)和波形蛋白(Vimentin)的表达水平并评价CD155对EMT的影响。MeRIP-RT-qPCR检测CD155是否受m^(6)A调控,Western印迹法和qRT-PCR测定METTL3是否影响CD155蛋白和RNA的表达水平。放线菌素D处理细胞后检测METTL3对CD155RNA半衰期的作用,利用预测网站m^(6)ATaget预测CD155RNA甲基化位点的识别者(Reader),运用Western印迹法和qRT-PCR分析YTHDF1是否影响CD155蛋白和RNA的表达水平,放线菌素D处理细胞后检测YTHDF1对CD155RNA半衰期的作用,RIP-RT-qPCR实验进一步确定YTHDF1和YTHDF1-mut对CD155RNA下拉能力。结果:CD155在宫颈癌组织和细胞中表达较高,体内高表达CD155的患者生存率较低。相比S12细胞,HeLa细胞中CD155的表达增加(t=3.749,P<0.05)。CD155的高表达促进了体外宫颈癌细胞的生长(t=3.152,P<0.05)、增殖(t=3.706,P<0.05)、迁移(t=5.422,P<0.01)和侵袭(t=3.599,P<0.05),抑制E-cad的表达促进了Vimentin的表达。MeRIP-RT-qPCR结果显示CD155RNA受m^(6)A调控,METTL3促进了CD155蛋白和RNA(t=6.725,P<0.05)的表达,敲降METTL3之后CD155RNA半衰期降低(t=5.622、6.063、5.857,均P<0.05)。敲降YTHDF1之后CD155的蛋白水平降低,CD155RNA半衰期降低(t=10.93、5.602、4.359,均P<0.05)。在YTHDF1高表达的细胞中,CD155RNA被有效免疫沉淀(t=4.686,P<0.01),但在YTHDF1-mut转染的细胞中,免疫沉淀结果显示下拉的CD155RNA水平明显降低(t=4.462,P<0.05)。结论:CD155RNA在m^(6)A修饰的情况下,被YTHDF1特异性识别,进而稳定性增强和翻译增加,CD155表达增加促进了宫颈癌细胞的恶性行为。