结核分枝杆菌MPT83蛋白的表达纯化及其在免疫学诊断上的应用

目的本试验旨在表达纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白,使用临床样本初步评估其在免疫学诊断结核病(tuberculosis,TB)中的应用价值。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增出mpt83基因,连接到pET-21a(+)中构建原核表达载体,转入感受态细胞DH5α,进行菌落PCR筛选阳性克隆。提取菌落PCR为阳性菌株的重组质粒pET-mpt83,对其进行双酶切鉴定,并将阳性克隆进行测序。将测序正确的质粒转入BL21感受态细胞中进行诱导、表达后通过镍柱亲和层析法纯化。使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及免疫印迹(Western Blot)鉴定纯化产物。用纯化MPT83蛋白免疫小鼠制备鼠多克隆抗血清。分别收集8例临床诊断结核性胸膜炎患者(TB组)的胸水和血浆,8例腺癌患者(CA组)的胸水和血浆以及8名健康对照者(HC组)的血浆。采用间接ELISA法检测样本中识别MPT83蛋白的特异性抗体水平。结果成功表达纯化出结核分枝杆菌MPT83蛋白。MPT83鼠多克隆抗血清效价可高达1∶1280000。TB组血浆MPT83抗原特异性抗体水平显著高于HC组,差异有统计学意义(P<0.05);而CA组血浆中抗原特异性抗体水平与HC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。TB组和CA组的胸水与HC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。利用ROC曲线分析不同稀释度下TB组血浆和HC组血浆OD值,曲线下面积均大于0.7,显示出较高的诊断效能。结论MPT83蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病免疫学诊断方面具有很大的应用价值。