翘嘴鲌(Culter alburnus)TMEM-57基因的克隆、组织表达和单核苷酸多态性分析

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了翘嘴鲌TMEM-57蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为2822bp,其中5′-UTR区93bp,3′-UTR区731bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1998bp,编码665个氨基酸。NJ法系统进化分析将同科或属中TMEM-57基因分成一个分支,表现出种属间的高度保守性。利用荧光定量PCR(qPCR)技术检测了不同组织的表达量,发现在卵巢中表达量最高,其次为心脏和脑。用直接测序法对TMEM-57基因部分区段单核苷酸多态性(SNP)进行了检测,寻找到11个新的SNP位点。

黑斑原(鱼兆)微卫星DNA富集文库构建与鉴定

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(CA)12寡核苷酸探针从黑斑原(鱼兆)基因组DNA MboI酶切的400—1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点,洗脱的杂交片段克隆到pMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出720个阳性克隆,占所有克隆的89.2%,从阳性克隆中随机选取139个进行测序,序列分析发现,124个克隆含有7个以上的重复序列,其中完全的为80个(64.5%),不完全的为40个(32.3%),复合的为15个(3.2%),重复次数范围为7—165次,平均为52次。在124条序列中共59条可以设计引物。

紫贻贝(Mytilus edulis)养殖群体的遗传多样性及遗传结构分析

基于线粒体DNA的COⅢ基因序列对我国沿海重要经济贝类紫贻贝3个养殖群体(烟台、乳山、东极)的遗传多样性和遗传结构进行了研究。由PCR扩增获得32个体的COⅢ基因750bp的部分序列,其多态性遗传参数统计显示,32个个体共检出18个单倍型,总群体单倍型多样性指数(Hd)为0.946,核苷酸多样性指数(Pi)为0.0207,平均核苷酸差异数(K)为15.316,三个群体均显示出较丰富的遗传多样性。遗传分化系数(Fst)表明,东极群体与烟台群体及乳山群体已明显分化,而烟台群体和乳山群体间无遗传分化,并且存在着较大的基因流。

大黄鱼(Larimichthys crocea)补体调节因子CFH和CFHR2基因的分子特征及表达分析

补体是鱼类免疫系统重要的组分,具有识别和消除外来病原体,激活免疫细胞,调控获得性免疫等功能。在免疫组织中,补体调节因子大约占据了补体成分的二分之一,当受到外界病原刺激时会迅速活化补体成分,并且进一步聚合形成酶复合物发挥一系列免疫效应。CFH和CFHR2是补体替代途径重要的调节因子,对于补体系统正常运转必不可少。为此,本文测定了大黄鱼补体调节因子CFH和CFHR2基因的c DNA全序列,并对基因组织特异性表达和溶藻弧菌刺激后基因m RNA表达量的变化等方面进行了研究。CFH和CFHR2序列全长分别为1332 bp和1170 bp,分别编码443和389个氨基酸,N端信号肽序列分别为24和32个氨基酸。推导的氨基酸序列结构分析表明大黄鱼CFH和CFHR2基因具有RCA蛋白家族的典型特征,即含有多个保守的CCP结构(补体控制蛋白)。实时荧光定量PCR结果显示,CFH和CFHR2在健康大黄鱼的肝、脾、肾、肠、脑、胃、心和肌肉这8种组织中都有表达,其中肝脏的表达量显著高于其它几种组织。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染了健康的大黄鱼之后,CFH和CFHR2的m RNA表达量均明显上调,并且随着感染时间的变化呈现不同的上升趋势。结果表明补体调节因子m RNA表达量的变化与溶藻弧菌的侵染密切相关,表明了CFH和CFHR2可能在大黄鱼自身免疫机制中发挥重要的作用。

大黄鱼(Larimichthys crocea)补体C3和C4基因的分子特征及表达分析

本文测定了大黄鱼C3(L.c-C3)和C4(L.c-C4)基因的c DNA全序列。结果表明,L.c-C3和L.cC4序列全长分别为4962bp和5088bp,分别编码1653和1695个氨基酸,N端信号肽序列分别为23和19个氨基酸。推导的氨基酸序列结构分析表明大黄鱼C3和C4与已报道的补体C3、C4同样都具有在功能上比较重要的残基以及保守的硫酯区。分子进化分析表明,L.c-C3和L.c-C4分别与鮸鱼C3、C4的氨基酸同源性最高。实时荧光定量PCR结果显示,L.c-C3和L.c-C4在健康大黄鱼的肝脏、脾脏、肠、鳃、心脏、脑、肌肉和胃这8种组织中都有表达,其中肝脏的表达量最高。在大黄鱼胚胎不同发育时期(从2细胞期到初生仔鱼)中,L.c-C3在各个阶段没有明显的变化,而L.c-C4的表达量有明显升高。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染的大黄鱼肝脏和脾脏中,L.c-C3和L.c-C4的m RNA表达量均明显上调。该结果表明,大黄鱼肝组织C3和C4基因表达变化与溶藻弧菌的侵染密切相关,揭示了C3和C4在大黄鱼抗细菌免疫反应中具有重要的作用。

柑橘衰退病和碎叶病复合感染病原的脱毒研究

以带毒柑橘品种为试材,采用植物中药制剂处理与热处理结合、茎尖微芽嫁接与植物中药制剂处理结合,用RT-PCR法检测病原带毒情况,并在药剂处理后1、3、5、7、9 d取样,检测抗性相关酶活性的含量变化,结果表明:采用板蓝根和黄芩混合中药制剂处理8次,结合热处理,在PC板制成的温室(白天40℃(6 h/d),晚上25℃,处理50 d)中,可有效地脱除试验苗木中柑橘衰退病和柑橘碎叶病复合感染病原;对柑橘茎尖微芽嫁接苗进行板蓝根和黄芩混合中药制剂脱毒处理后苗木经RT-PCR法检测表明:85.7%植株可以脱除柑橘衰退病和柑橘碎叶病病毒;药剂处理后PPO、POD、SOD酶活性与对照相比均有所提高。

苯并[a]芘(BaP)急性暴露对泥蚶消化腺的毒性效应及其应对机制初探

本文研究了苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,Ba P)急性暴露对泥蚶(Tegillarca granosa)的毒性效应,并以泥蚶的消化腺为目标组织,对泥蚶抵抗BaP毒性的机制进行了初步探究。对样本进行HE染色并对所采集的图像进行分析处理,结果发现,暴露于BaP导致泥蚶消化腺组织出现坏死。对样本进行脂质过氧化并进行DNA氧化损伤测定的结果显示,暴露于BaP导致泥蚶消化腺氧化压力增加,进而导致脂质过氧化以及DNA氧化损伤等细胞层面的损伤。抗氧化酶活性测定结果显示,BaP胁迫诱导泥蚶产生氧化应激反应,抗氧化防御体系积极参与BaP诱导的氧化应激调控过程。神经毒性指标测定结果显示,BaP胁迫可能影响泥蚶神经冲动的传导而具有神经毒性。此外,DNA甲基化水平测定及抗氧化酶基因表达测定的结果显示,泥蚶可能通过降低DNA甲基化水平来激活抗氧化系统以对抗BaP毒性。综上所述,急性BaP暴露会对泥蚶产生显著的毒性效应,以组织损伤、氧化应激反应和神经毒性为主要表征;泥蚶可能通过调整自身DNA甲基化水平来对抗BaP毒性效应。通过本研究,有望为深入探索双壳贝类应对石油污染物胁迫的内在调控机制提供新思路,同时为石油污染威胁下泥蚶的生物资源保护提供参考。

长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究

以长蛸DNA为模板,利用单因子试验分别对影响长蛸ISSR-PCR反应的DNA浓度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最适退火温度,最终确定长蛸最佳反应体系和PCR扩增程序为:25μL体系,其中包括Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg2+2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板量约50 ng确立退火温度为52℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生长蛸样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的条带,研究结果对于把ISSR标记技术引入研究长蛸不同地理群体遗传多样性和遗传结构具有重要意义。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)ISSR体系优化及养殖群体遗传多样性分析

采用ISSR-PCR技术对曼氏无针乌贼基因组DNA进行扩增,筛选分析了ISSR-PCR扩增时的主要影响因子,包括Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度以及退火温度,并用8条ISSR引物对舟山养殖群体进行了遗传多样性分析,最终确立的适用于曼氏无针乌贼ISSR扩增的25?l反应体系为:Mg2+1.5mmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,引物0.15?mol/L,dNTPs2.0mmol/L,退火温度为52.2℃。结果表明,扩增得到70个清晰的扩增位点,其中多态性位点60个,多态位点率为85.71%,Nei's基因多样性为0.3105±0.1760,Shannon's多样性指数为0.4610±0.2397。本研究结果表明,舟山曼氏无针乌贼养殖群体遗传多样性较丰富,因此舟山曼氏无针乌贼养殖群体可能有比较高的适应生存的能力,蕴藏着比较大的进化潜能及比较丰富的育种潜力。

黑斑原鮡AFLP分析体系的建立

建立黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)AFLP反应体系,对DNA提取、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增和银染效果进行了探索。结果表明,40μLTaqI酶切体系中65℃先酶切2h,EcoRI酶切和连接同时进行,EcoRI酶和T4DNA连接酶的用量均以2U为宜,温度与时间分别为37℃和3h,连接产物稀释10倍作为预扩增的模板。利用这种优化的反应体系,5对选择性扩增引物组合表现出较高的稳定性、清晰度和多态性,它们分别是:E-AAC/T-AAT、E-AAC/T-AAG、E-AAG/T-ACA、E-AAG/T-AAT和E-AAT/T-AGA。5对引物组合对96个样本扩增,共得到332条清晰可辨、可重复的条带,平均每对引物组合扩增出66.4条带,其中51条带是多态的。将AFLP技术用于黑斑原鮡的研究,通过优化体系的建立,为其种质资源的研究奠定基础。

曼氏无针乌贼Phb2基因的克隆和其在不同生长阶段的表达分析

Phb2是抗增殖蛋白(Prohibitin)的一个亚型。本研究利用RACE技术首次获得了曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)Phb2基因的全长序列,该序列全长为1283 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)150 bp,3′非编码区(3′-UTR)236 bp,开放阅读框(ORF)897 bp,预测编码298个氨基酸。序列分析表明,曼氏无针乌贼Phb2基因编码的蛋白无信号肽,第20~42位氨基酸为跨膜结构,包含1个PHB家族的结构域。采用荧光定量PCR技术检测其在曼氏无针乌贼不同生长时期(幼体、产卵前、产卵中、产卵后濒死前)各组织中的表达情况,结果显示,Phb2在4个时期的各组织中均有表达,其中,幼体和濒死前表达量较低,产卵前和产卵中的表达量则相对较高,在各时期中脑、肝表达较多。视腺作为与生殖调控有关的内分泌器官,其Phb2基因表达具有时期差异性,在产卵后的表达量由产卵时期的高表达大幅下降,说明Phb2具有周期调节、控制细胞衰老和凋亡的多效性功能。本研究结果可为进一步了解抗增殖蛋白对曼氏无针乌贼的抗衰老作用提供参考。

曼氏无针乌贼转录组微卫星特征分析

本研究基于高通量测序获得的曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)转录组数据,采用MISA(MIcro SAtellite)软件对其简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR)位点进行了高通量发掘。组装并去冗余后,得到127575个Unigene,序列拼接的总长度为103104058 bp。对Unigene序列进行SSR分析,共得到62124个SSR(完整型SSR 36813个),分布在50626条Unigene序列当中,SSR出现频率为48.70%,平均16.6 kb出现1个SSR。微卫星序列主要以二碱基重复类型为主(31227,50.27%),其次为三碱基重复(16230,26.13%)。共发现122种碱基重复基元,在所有重复基元中(AT/AT)n占的比例最高为23.33%,其次为(AAAG/CTTT)n(17.42%)。曼氏无针乌贼SSR(完整型)的平均长度为25.87 bp,微卫星主要为重复长度大于20 bp的长序列,长度大于20 bp的微卫星序列占总数的51%。本研究发现,曼氏无针乌贼微卫星出现的频率和其长度呈极显著负相关(P<0.01),相关系数为–0.594。该研究结果为开发高度多态性微卫星引物进行曼氏无针乌贼亲缘关系鉴定、种群遗传多样性和增殖放流效果评估等研究奠定了基础。

基于F型mtDNA D-Loop的厚壳贻贝(Mytiluscoruscus)群体遗传多样性研究

为研究东海区厚壳贻贝(Mytilus coruscus)遗传多样性,以厚壳贻贝F mtDNA D-loop为标记,对浙江省舟山嵊山岛、宁波渔山岛、温州南麂岛、福建省宁德湾和莆田南日岛五个海区的厚壳贻贝群体进行了遗传分析。结果表明,厚壳贻贝各群体的遗传多样性差异不明显,在5个群体中,宁德群体的遗传多样性相对最丰富;将5个群体作为一个整体时,呈现出较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性。对厚壳贻贝5个群体间的遗传分化系数(Fst)和基因流(Nm)进行检测,结果显示群体间Fst值都很低,但Nm值都很高(Nm绝对值>1),表明5个群体间存在丰富的基因交流。但宁德群体与浙江沿海的3个群体(嵊山、渔山、温州)的Fst值相对较高,且差异显著(P<0.5),表明宁德群体与这3个群体间出现遗传分化。本研究旨在为海洋经济贝类资源的保护管理提供理论依据。

Nrf2参与水生动物氧化应激调控的研究进展

环境变化会诱导机体活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高,从而产生氧化应激。氧化应激对所有生物的生存、生长、发育和进化都具有深远的影响。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)被公认为细胞氧化应激调控的主导者,与伴侣蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)一起控制数百个解毒酶和抗氧化蛋白编码基因的表达。近年来,Nrf2在水生动物中逐渐获得重视,并在一些模式鱼类如斑马鱼、鲤鱼及其他一些鱼类和水生无脊椎动物中得到研究。介绍了Nrf2的结构以及调控机制,回顾了近年来水生动物Nrf2通路参与氧化应激调控所取得的进展。研究表明,Nrf2在水生动物中广泛存在,在非生物(金属、有机污染物、无机盐、药物及微塑料等)、生物(细菌、病毒、有毒藻类)以及生境变化(冰融、盐胁迫)诱导的氧化应激调控中发挥重要作用。Nrf2一经激活入核,在小Maf蛋白的协助下与抗氧化反应元件(antioxidant-response element,ARE)结合,启动一系列ARE驱动基因的表达,并和孕烷X受体(pregnane X receptor,Pxr)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)以及芳烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)等细胞通路协同作用参与一系列生理过程。Nrf2在水生动物响应环境变化过程中发挥重要的细胞保护机制,有望发展成为抗逆育种潜在的基因靶点。

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)金属硫蛋白MT-10:cDNA克隆、结构分析及铜离子胁迫下的表达

近年来我国沿海海域重金属污染日趋严重,软体动物尤其是双壳贝类响应重金属污染胁迫的研究发展成为目前的研究热点。金属硫蛋白是一类广泛存在于生物体内富含半胱氨酸(Cys)的小分子蛋白,具有结合金属离子的能力,能有效调节生物体细胞内的金属离子平衡,具有清除自由基,重金属解毒的功能,关于厚壳贻贝MT蛋白的研究尚未见报道。本文首次利用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术克隆了厚壳贻贝MT-10蛋白c DNA全长(Mc-MT-10),其包含101bp的5′UTR区,108bp的3′UTR区以及222bp的ORF区,编码73个氨基酸。经比对发现Mc-MT-10富含Cys,且具有9个软体动物中常见的CXC结构以及CKCXXXCXCX结构,系统进化树中同科或属中MT-10聚合成一个分支,显示出高度保守性。采用Q-PCR技术分析了MT-10 mRNA在Cu^(2+)胁迫下厚壳贻贝外套膜及消化腺中表达变化,结果表明Mc-MT-10 mRNA在Cu^(2+)胁迫下两种组织中的表达量急剧升高,说明Cu^(2+)能够诱导Mc-MT-10 mRNA的表达,并且表现出诱导具有阈值性特点。研究结果可为深入研究厚壳贻贝MT蛋白的功能奠定基础,为厚壳贻贝抗重金属污染新品种选育提供数据支持。

基于转录组的曼氏无针乌贼SSR与SNP位点信息分析

利用IlluminaHiseq平台对曼氏无针乌贼进行了转录组测序,采用生物信息学方法分析了转录组序列中的SSR、SNP位点信息并设计了SSR引物。利用MISA工具筛选了转录组测序获得的127 575条Unigene序列,共得到分布于50 626条序列中的SSR位点108 685个,SSR发生率39.68%,出现频率为85.19%。平均每949 bp含有1个SSR位点。在50 626条含有SSR位点的Unigene序列中,有25 548条Unigene包含SSR位点数目在2个及以上。其中单碱基重复是EST微卫星序列的主要形式(42.84%),其次是二碱基重复(28.73%),三碱基重复(14.93%)和四碱基重复(12.79%)。在所有微卫星序列所包含的重复单元中,优势重复基元类型为A/T(占总SSRs的42.23%),其次为AT/AT (13.33%),AC/GT (9.32%),AAAG/CTTT (10.00%)。运用Primer premier 5软件共设计了46 520对SSR引物。在12 323条Unigene中发掘出SNP位点64 732个,每条Unigene平均含5.25个SNP位点。其中转换(Transition) 45 975个(71.02%),颠换(Transversion) 18 757个(28.98%)。本研究通过第二代高通量测序技术,结合生物信息学方法对曼氏无针乌贼进行了SSR位点与SNP位点的开发,为其遗传多样性分析、分子辅助育种和增殖放流效果评估等提供了有力研究工具。

扁玉螺转录组SSR信息分析

采用生物信息学方法分析扁玉螺转录组文库EST序列(SSR)位点,并且设计简单重复序列(SSR)引物,以期为扁玉螺分子标记辅助育种提供有力的工具。对扁玉螺进行转录组测序采用Illumina Hiseq^(TM)高通量测序平台,再利用Micro SAtellite(MISA)工具,分析扁玉螺转录组中SSR的重复基元及其分布频率。利用Primer 3软件设计引物,并且通过SSRFinder筛选出SSR引物。从233 853条Unigenes中找到202 337个符合条件的SSRs,发生频率为45.34%,SSR位点的出现频率为86.53%。SSR位点中单核苷酸重复是主要类型,占总SSRs的63.44%,其次为双核苷酸和三核苷酸,分别为24.12%和6.73%。SSR所包含的重复基元中,单核苷酸重复基元A/T最多,占总SSR的54.15%;其次为双核苷酸AC/GT多,为15.9%。扁玉螺转录组中SSR位点出现频率高,而且类型丰富;大量的SSR分子标记技术有助于扁玉螺分子育种与遗传多样性分析提供更多的依据。

苯并[a]芘(BaP)对褐菖鲉(Sebasticus marmoratus)肝CYP1A1酶活性、基因表达及蛋白表达的影响

为了了解苯并[a]芘(BaP)对鱼类细胞色素P4501A1(CYP1A1)表达的影响,以褐菖鲉(Sebasticus marmoratus)为实验材料,采用体内实验,研究其在经过不同浓度(0.1、1、10、20、50mg/kg鱼体重量)的BaP诱导后,鱼体肝脏研究CYP1A1基因表达的情况,筛选出后续时间-效应实验中BaP注射的最佳浓度,研究BaP诱导6h、12h、1d、3d、7d后(质量浓度为20mg/kg鱼体重量)鱼体肝脏CYP1A1酶活性、基因表达和蛋白表达的情况。结果表明:剂量-效应实验中,20mg/kg鱼体重量为最佳浓度,此浓度下,基因表达在各组中变化最显著。时间-效应实验中,较空白对照组而言,染毒6h、12h和1d后,EROD酶活性显著增加。3d后开始下降,与对照组相比变化不大,7d后酶活性又发生上调。半定量RT-PCR结果表明,各染毒组与对照组相比,CYP1A1基因表达量都发生了上调,呈现先上升后下降的趋势。其中,6h和12h组相对表达量极显著增加,1d后开始下降且与3d和7d组相比变化不明显。Western blot结果表明,蛋白表达量在染毒12h后表现出显著的诱导效应,随着时间的延长略有回落,但与对照组相比仍有显著性差异。研究表明:BaP对褐菖鲉CYP1A1具有较强的诱导作用。一定质量浓度的BaP注射于褐菖鲉不同的时间后,能诱导褐菖鲉活体EROD酶活性、CYP1A1基因m RNA表达及蛋白表达,并随着时间的延长呈现先诱导后抑制的趋势。这说明BaP作为诱导剂对CYP1A1酶活性和蛋白表达的作用机制可能与调控CYP1A1的转录水平有关。

水生衰老模式动物研究进展

水生动物数目和种类繁多,水圈是地球上生命的发源地。衰老是生物界的普遍现象与规律,近年衰老相关研究成为生物学研究热点,但目前对于水生动物的衰老研究还远远不足。本文就衰老经典理论进行了系统的综述,分析了衰老模式生物建立的原因及其特点,阐述了衰老在水生模式动物中的表现,旨在为水生动物衰老研究提供理论依据与参考;同时,本文对衰老研究在曼氏无针乌贼上的应用前景进行了展望,对曼氏无针乌贼的资源恢复及增养殖产业必将有重要的指导意义。

甲状腺激素在无脊椎动物中的研究进展

甲状腺激素(thyroid hormone, TH)具有多种功能,包括调节新陈代谢、生理发育以及调控神经系统。TH及其他含碘化合物广泛存在于海洋无脊椎动物中,刺激甲状腺激素核受体(thyroid hormone receptors, THRs)产生各种应答反应。本文基于已有的研究,就海洋无脊椎动物中TH的功能及其作用机制进行了综述,分析了TH信号通路的类型及其机制,阐述了TH在无脊椎动物中的作用、THR及其亚型的种类以及THR调控机制的类型与特点。本文旨在通过借鉴已知部分脊椎动物信号通路,对无脊椎动物信号通路下游进行更深入的研究。同时,本综述对各门无脊椎动物中THR的作用机制和TH的非基因组功能的研究具有重要的借鉴意义。