黄鳝来源阿氏芽孢杆菌的筛选及发酵条件优化

试验旨在从人工养殖的黄鳝体内分离高产蛋白酶菌株,为后续微生物蛋白酶的制备和微生态制剂的开发提供菌种资源,以解决黄鳝摄食率低、消化不完全及水体氮污染等问题。通过采用脱脂奶粉培养基透明圈法初筛和Folin-酚法测定酶活复筛相结合的方式筛选人工养殖黄鳝肠道中的高产蛋白酶菌株,通过溶血试验与药敏试验检测菌株安全性,并进行常规生化和分子生物学鉴定。通过单因素和正交试验优化其发酵条件,筛选到一株高产蛋白酶、产过氧化氢酶的菌株Ma-4,初步鉴定其为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。该菌株最适产酶条件为发酵时间48 h、发酵温度36℃、可溶性淀粉添加量15 g/L、牛肉浸粉添加量15 g/L和pH值6.0。优化后菌株酶活力为288.14 U/mL,较优化前提高了3.34倍。研究表明,菌株Ma-4为高产蛋白酶、产过氧化氢酶、不溶血、不耐药的阿氏芽孢杆菌,该菌株为开发黄鳝微生态制剂开拓了菌种资源。

翘嘴鳜肝脏组织原代细胞培养技术的建立

运用组织块贴壁法、酶消化法、组织块联合酶消化法探究体质量(33.2±0.2)g翘嘴鳜肝脏组织原代细胞最适培养方法,采用3种培养基(M199培养基、L15培养基、M199-L15)、3种培养容器(12孔板、6孔板、T25培养瓶)及有无CO_(2)探究翘嘴鳜肝脏组织原代细胞最适培养条件,采用线粒体16S rRNA基因序列和染色体数目鉴定细胞,研究氯化铵(0、1、5、10mmol/L)对细胞形态和增殖的影响。试验结果显示:0.25%胰蛋白酶-EDTA消化翘嘴鳜肝脏组织获得细胞,接种到T25培养瓶,生长培养基为M199-L15(体积比1∶1)混合培养基并添加20%体积胎牛血清,在28℃含5%CO_(2)的培养箱中培养,第2~3天贴壁细胞占瓶底的25%~30%,第4~5天细胞长满瓶底的70%~80%,第6~7天得到可传代的原代细胞;传代后细胞饱满、增殖能力强,为上皮样和成纤维样的混合,以成纤维样细胞为主,已传到10代;细胞线粒体16SrRNA基因测序结果与GenBank中基因序列(HQ731435.1)的一致率达99.05%,染色体数目为48条,证明此细胞来自翘嘴鳜;5mmol/L和10mmol/L氯化铵暴露对细胞形态和活力有显著影响(P<0.05)。本试验建立了翘嘴鳜肝脏组织原代细胞培养技术,为开展翘嘴鳜生物学、疾病学、营养学及遗传学等提供重要基础,同时为鱼类肝脏组织细胞原代培养和建系提供重要参考。

鲫腹膜分布、组织学及光照对其影响研究

腹膜在脊椎动物中普遍存在,由间皮细胞构成,通过结缔组织的支持作用形成的一层膜状组织,具有润滑、支持和保护等功能。鱼类有腹膜且分布有色素细胞,本研究选取常见经济鱼类鲫(Carassius auratus)为实验对象,采用组织学方法研究其腹膜分布及色素细胞形态特征,并探究光照条件对鲫腹膜色素细胞的影响。结果显示:(1)鲫腹膜呈黑色,腹腔腹壁内侧、心腹隔膜靠近腹腔一侧有明显分布,腹腔腹壁内侧黑色腹膜在腹腔上方延伸包裹性腺后相连覆于鳔下侧。(2)鲫腹膜黑色素细胞为黑色的树突状细胞。(3)鲫腹腔腹壁内侧腹膜的石蜡组织切片显示黑色素细胞连续分布形成黑色色素带,细胞核椭圆形、呈蓝紫色;扫描电镜下腹膜组织凹凸不平,由嵴组成多角形的网状结构;透射电镜下黑色素细胞有细胞核和黑素小体,黑素小体分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个时期。(4)不同光照影响鲫腹腔腹壁内侧腹膜黑色素细胞的形态,光照组黑色素细胞胞体变大、分支变粗,呈色变深;黑暗组黑色素细胞胞体变小、分支变细长。本研究为鱼类腹膜系统研究提供理论参考。

不同养殖模式黄鳝胃肠道微生物群落结构分析

为探究不同养殖模式下黄鳝(Monopterus albus)胃肠道微生物的群落结构,本实验采用16S rRNA高通量测序技术研究虾塘散养、蟹塘散养、网箱投喂鱼浆和网箱投喂水蚯蚓4种养殖模式下黄鳝胃肠道微生物的组成和群落结构。Alpha多样性分析和Venn图结果显示,网箱投喂水蚯蚓组黄鳝胃肠道微生物多样性和丰度均较高,而蟹塘散养组最低。除蟹塘散养组黄鳝肠道的优势菌为变形菌门,其余3种养殖模式黄鳝胃肠道优势菌群均为厚壁菌门,推测黄鳝胃肠道微生物的核心菌群为厚壁菌门。在属水平上,网箱投喂水蚯蚓养殖模式中黄鳝胃的优势菌群为粪杆菌属(Faecalibacterium)与嗜黏蛋白阿克曼菌属(Akkermansia),其余3种养殖模式中黄鳝胃的优势菌群都为韦荣球菌属(Veillonella);而虾塘散养组黄鳝肠道的优势菌群为瘤胃球菌属(Ruminococcus),其余3种养殖模式的优势菌群中都有双歧杆菌属(Bifidobacterium)。结果表明:网箱投喂水蚯蚓组黄鳝胃肠道微生物多样性和丰度均较高,且益生菌群占比高,潜在致病菌较少,是比较健康的养殖模式。

中国胭脂鱼的细胞遗传学分析

采用植物血凝素、秋水仙素活体注射和肾细胞直接制片法分析了中国胭脂鱼(Myxiocyprinus asiaticus)的染色体核型和Ag-NORs显带;并以中国胭脂鱼血细胞为样本,鸡血细胞DNA含量为标准(2.50 pg),用流式细胞仪测定了中国胭脂鱼的DNA含量。结果表明:(1)中国胭脂鱼染色体数目2n=100,核型公式为10 m+4 sm+12 st+74 t,NF=114,未观察到次缢痕及随体,亦未发现有性染色体。(2)中国胭脂鱼染色体具有1对Ag-NORs,位于第1对染色体短臂上,间期核中Ag-NORs的数目为1-2个,未见Ag-NORs的联合现象。(3)PI和DAPI作为荧光染料,得出中国胭脂鱼DNA含量分别为5.50±0.24 pg和6.16±0.03 pg。(4)中国胭脂鱼为四倍体,在特定的分类阶元中属于较原始的鱼类。

高等农业院校基础生物化学实验课的改革探索

基础生物化学实验课是高等农林院校重要的专业基础课,在本科教学中起着举重轻重的作用.本教学团队梳理多年的经验,系统优化课程设置和教学内容,让学生参与到实验准备中,分段式授课,设置实验随堂考试及全方位考核学生的成绩.经过实践发现这些改革措施调动了学生的积极性和主动性,提高了学生的创新能力和综合素质.

草鱼受精卵菌群的研究

对草鱼受精卵及所处水体的好氧及兼性厌氧菌的数量和组成进行了研究。结果表明：草鱼受精卵菌群的数量随受精卵的发育呈递增趋势,刚受精时每个受精卵的细菌数量为1.24×10^1cfu,出膜前增加到1.41×10^5cfu。水体中细菌的数量相对稳定,为1.05×10^4-3.85×10^4cfu/mL,只在受精卵出膜前的阶段急剧增加,为1.32×10^6cfu/mL。随受精卵的发育,受精卵的优势菌群先为气单胞菌属（Aeromonas）、肠杆菌科（Enterobac-teriaceae）、微球菌属（Micrococcus）和棒杆菌属（Corynebacterium）,后为莫拉氏菌属（Moraxella）和不动杆菌属（Acinetobacter）。水体中的优势菌群为气单胞菌属（Aeromonas）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和莫拉氏菌属（Moraxella）。受精卵的优势菌群与其所处水体的优势菌群基本相同。

草鱼和银鲫肠道产消化酶细菌的研究

检测了分别从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和银鲫(Carassius auratus gibelio)肠道中分离的180株细菌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的产酶能力。结果显示,两种鱼肠道内可分泌胞外消化酶的细菌包括Aero-monas(气单胞菌属,Aer.)、Vibrio(弧菌属,Vib.)、Bacillus(芽孢杆菌属,Bac.)、Pseudomonas(假单胞菌属,Pse.)四个种属的细菌,Aer.在其中占主要优势,45.71%的Aer.可分泌胞外消化酶。草鱼可分泌上述四种胞外消化酶的菌株共有33株,占肠道菌总数的36.67%;银鲫43株,占47.78%。产酶菌的分布上,草鱼中肠内产消化酶细菌数量显著多于前肠和后肠(P<0.05),前、中、后肠分别是6株、20株和7株;银鲫中肠和后肠数量差异不显著,前肠分布最少。草鱼分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的菌株分别有21株(23.33%)、10株(11.11%)、30株(33.33%)和16株(17.78%)。银鲫肠道内未检测到可分泌纤维素酶的细菌,蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶菌株的数量分别是21株、37株和17株。可见鱼类肠道细菌对食饵消化有重要作用。

麦穗鱼的组型分析和DNA含量测定

采用PHA和秋水仙素活体注射、肾细胞短期培养和空气干燥制片法,对麦穗鱼染色体数目和核型进行研究;以麦穗鱼外周血细胞为样本,鸡血细胞DNA为标准(2.30pg),使用美国贝克曼库尔特公司Cell LabQuanta SC流式细胞仪测定了麦穗鱼二倍体细胞的DNA含量。结果显示:麦穗鱼染色体数目2n=50,未观察到次缢痕及性染色体,亦未发现有随体,核型公式为18m+22sm+10st,NF=90;麦穗鱼二倍体细胞DNA含量为鸡血对照的1.38倍,绝对含量为3.18pg。

云芝多糖对银鲫非特异性免疫功能的影响

将云芝多糖（Coriolus versciclor polysaccharides，CVP）按不同的剂量（0、0．25、0．5、1．0、2．0和4．0g／kg）添加到银鲫（Carassius auratus gibelio）的基础饲料中，连续投喂56d，并在试验的第0、7、14、21、28、35、42和56天取样检测CVP对供试鱼血液的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活力、血清超氧化物歧化酶（SOD）活性和补体C3、C4的含量共5种指标的影响。结果显示，饲料中添加0，25g／kg的云芝多糖，对银鲫的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活力、血清SOD活性和补体C3、C4含量的影响不显著（P〉0．05）；添加0．5g／kg、1．0g／kg的云芝多糖，对5种指标有一定程度的促进作用，并当添加量为1．0g／kg时，在14～21d时效果最显著（P〈0．05）；而添加2．0g／kg和4，0g／kg的云芝多糖，5种指标在试验的后期显著低于对照组（P〈0．05）。结果表明，在银鲫饲料中添加0．5～1．0g／kg的云芝多糖对银鲫的非特异性免疫功能有增强作用。

果寡糖对银鲫非特异性免疫功能的影响

为研究果寡糖(Fructooligosaccharides)对银鲫(Carassius auratus)非特异性免疫功能的影响,以50g左右的银鲫为实验对象,在其基础饲料中分别添加浓度为0.5g/kg(A1组)、1g/kg(A2组)、2g/kg(A3组)、4g/kg(A4组)的果寡糖,另设基础饲料为对照组(A0组),分别于7d、14d、21d、28d、42d、56d检测银鲫血液中白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活力、血清SOD酶活性和补体C3的含量。结果表明,A2组的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活力、血清SOD酶活性和补体C3的含量显著高于A0组(p<0.05),分别于第28、第21、第14、第14天达到最大值;A3组的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活力、血清SOD酶活性和补体C3的含量显著高于A0组(p<0.05),分别于第14、第14、第7、第14天达到最大值。A3组的补体C3的含量显著高于A2组(p<0.05),白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活力、血清SOD酶活性与A2组相比差异不显著,但其活性高于A2组。A1组、A4组与A0组之间的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活力、血清SOD酶活性和补体C3的含量在各时间点均无显著差异。

三个地理种群鲂的形态差异与判别分析

采集了北江、钱塘江、金沙河水库3个地理种群的鲂(Megalobrama skolkovii)414尾样本,用传统形态学和框架分析法,运用单因素方差分析、聚类分析、主成分分析和判别分析法比较研究了37个形态比例性状。结果表明:3个种群的口裂长/头长、吻长/头长、口宽/头长、上颌厚/头长、全长/体长、体厚/体长、头长/体长、尾柄长/体长、尾柄高/体长、尾柄长/尾柄高、1-2/体长、1-3/体长、2-4/体长、2-5/体长、3-5/体长、4-5/体长、4-6/体长、4-7/体长、5-6/体长、6-8/体长、6-9/体长、7-8/体长,及7-9/体长23个性状差异显著(P<0.05)(1:吻端;2:头部后缘;3:胸鳍起点;4:背鳍起点;5:腹鳍起点;6:背鳍基部末端;7:臀鳍起点;8:尾鳍背部起点;9:尾鳍腹部起点);聚类结果显示,北江与金沙河水库首先聚为一类,认为北江群体与金沙河水库群体形态最为相似;主成分分析构建了9个主成分,累计贡献率为60.26%;以Bayes逐步判别分析方法选用18个判别效果较好的比例性状建立了3个鲂地理种群的判别函数,判别率为99.03%。结果显示,可以通过形态比例性状来判断鲂的3个地理群体的归属。

鲂属鱼类形态差异分析

为探讨鲂属鱼类种内及种间形态差异,采用单因素方差分析及主成分分析对厚颌鲂(Megalobrama pellegrini)、广东鲂(M.hoffmanni)、鲂(M.skolkovii)和团头鲂(M.amblycephala)共382尾样本的23个可数性状和24个可量性状进行分析和比较。结果表明,4种鲂的可数性状(尾部脊椎数),可量比例性状(口宽/头长、眼径/头长、腹鳍棘长/头长、肠长/体长、尾柄高/体长、第一鳔室长/体长、第二鳔室长/第一鳔室长、尾柄长/尾柄高)存在显著性差异,可作为4种鲂的判别性状。通过主成分分析法对可数性状(可量比例性状)构建了3个主成分,其贡献率分别为:26.28%(26.01%)、19.92%(12.05%)和8.04%(10.18%),累计贡献率54.24%(48.24%)。主成分散点图显示,4种鲂聚为4簇,广东鲂、团头鲂区分明显。

团头鲂三倍体的诱导及其鉴定

采用冷休克抑制第二极体释放的方法诱导团头鲂三倍体，筛选出有效的处理温度、起始时问和持续时间，并比较了3种团头鲂倍性鉴定的方法。在孵化水温26～27℃，起始时间为受精后3min，0～2℃持续处理25min的效果最佳，孵化率和三倍体诱导率分别达到34．31％和60．67％。处理温度、起始时问、持续时间均会对三倍体的诱导率产生不同影响。采用染色体计数、DNA含量测定和红细胞大小测定法分别对三倍体个体进行了鉴定。结果显示，三倍体的染色体3n=72，对照组二倍体2n=48；流式细胞仪测定的三倍体与二倍体DNA含量差异极显著（P〈0．01），其比值为1．49：l；三倍体与二倍体的红细胞及核大小的各项数据之间均存在差异显著性，尤其是核体积和红细胞体积存在着极显著差异（P〈0．01），三倍体红细胞和核体积分别为二倍体的1．40倍和1．51倍。染色体计数、DNA含量测定和红细胞（核）的大d,N量方法都可以准确鉴定团头鲂三倍体个体。

麦穗鱼耗氧率和窒息点的测定

为研究麦穗鱼的基础代谢水平和特点,将暂养7d的麦穗鱼停食24h后,放入自行设计的封闭流水式呼吸室内,调节水位及进出口流量,测定两种规格麦穗鱼的耗氧率、耗氧量和窒息点。试验结果表明,平均体长(9.24±3.06)cm、体质量(12.32±1.44)g的麦穗鱼在水温为(24.0±0.1)℃时的耗氧率和耗氧量分别为(0.16±0.01)mg/(g·h)、(1.54±0.83)mg/(尾·h);平均体长(4.10±0.06)cm、体质量(0.53±0.09)g的麦穗鱼在温度为(16.5±0.5)℃时耗氧率和耗氧量分别为(0.59±0.24)mg/(g·h)、(0.31±2.01)mg/(尾·h),平均体质量(12.32±1.44)g,平均体长(9.24±3.06)cm的麦穗鱼在水温(24.0±0.1)℃,pH 7.4的条件下,窒息点为0.58mg/L。麦穗鱼的耗氧率夜间略高于白天,但差异不显著;麦穗鱼的耐低氧能力属中等偏弱水平。

梁子湖团头鲂的年龄和生长特征

为了解梁子湖团头鲂Megalobrama amblycephala的种群现状,于2011年7月-2012年6月采集310尾样本,以鳞片作为鉴定材料,对团头鲂的年龄和生长特征进行研究.结果表明：团头鲂年轮环纹呈疏密切割型,偶见幼轮,3龄以上个体可见生殖痕;种群体长分布范围为74.1～362.8mm,优势体长为180 ～320 mm,占群体总数的81.29％;群体由1～6龄共6个龄组组成,优势年龄组为3～4龄,占总渔获物的55.48％;体长（L）与鳞径（R）呈线性关系,关系方程为L=34.656R＋25.21;体长与体质量（W）呈幂函数关系,关系方程为W=1×10-5L3.1228,幂指数接近3,属匀速生长型;拟合Von Bertalanffy方程为Lt=452.36（1-e-0.2407（t＋0.2813））,Wt=2034.61（1-e-0.2407（t＋0.2813））3.1228,生长拐点时间ti=4.46龄,此时体长Li=307.78 mm,体质量Wi=607.70 g.研究表明,梁子湖的团头鲂资源量日趋减少,种群出现了明显的小型化趋势,应当采取保护措施,以利于资源的恢复和增殖.

麦穗鱼鳍条组织培养及染色体Ag-NORs和C-带研究

采用组织块贴壁培养法探索麦穗鱼(Pseudorasbora parva)鳍组织细胞的短期培养,同时对其染色体Ag-NORs和C-带进行了初步研究。结果显示:1)麦穗鱼鳍组织培养的最适培养基为MEM培养基,细胞在组织块贴壁后第6天迁出,经传代后细胞形态呈成纤维状;2)其染色体具有1对Ag-NORs,位于第23对染色体短臂末端,其NORs具多态性,未见Ag-NORs联合现象;3)其染色体C-带主要为端粒和着丝点C-带,少数为居间C-带,其中第23对染色体的短臂大部分呈现C-带强阳性,与Ag-NORs区域对应。

麦穗鱼不同组织DNA含量及细胞周期的分析研究

为了解鱼类各组织DNA含量和细胞周期情况,同时丰富鱼类活体测定基因组大小的检测材料。以麦穗鱼(Pseudorasbora parva)为实验材料,采用流式细胞仪测定了7种不同组织的DNA含量并对其细胞周期进行了分析。结果表明:麦穗鱼的血液、肌肉、鳍条、鳃、肝脏、肾脏和性腺7种组织的DNA含量存在不同程度的差异,几种组织DNA含量大小排序依次为:肌肉>血液>鳍条>肝脏>性腺>肾脏=鳃,肌肉的DNA含量最高,达到3.20×10-6μg,肾脏和鳃组织DNA含量最低,仅为3.05×10-6μg,鳍条组织DNA含量与血液DNA含量相近,可以作为活体测定基因组大小的材料;血液和其他几种组织一样都表现出了一定的细胞周期现象,其中性腺和肝脏组织的G0/G1期时相的比例较低,并且这2种组织的细胞增殖指数比较高,分别为17.81%和13.19%,而鳃组织的细胞增殖指数最低,仅为6.54%,同时几种组织的细胞周期时相也存在着不同的差异。

北江鲂年龄与生长特征的研究

2011年9月,在北江采集鲂(Megalobrama skolkovii)样本326尾,以鳞片作为年龄鉴定材料,进行年龄与生长的研究。研究结果显示:鲂渔获物由2～7龄组成,3～5龄为优势年龄组,占渔获总量的87.42%;优势组体长为190～270 mm,占渔获物的44.79%;体质量集中在100～800 g,占渔获物的70.25%。体长鳞径呈线性相关,雌鱼:L=44.281R+16.927;雄鱼:L=41.483R+23.732。体长体质量呈现幂函数关系,雌鱼:W=4×10-5L2.950 2,雄鱼:W=5×10-5L2.871 7,生长均属于等速生长型。北江鲂生长符合Von Bertalanffy方程,雌鱼:Lt=480.52(1-e-0.234 3(t+0.239 5)),雄鱼:Lt=462.05(1-e-0.235 1(t+0.306 2));雌鱼:Wt=3052.92(1-e-0.234 3(t+0.239 5))2.950 2,雄鱼:Wt=2400.78(1-e-0.235 1(t+0.306 2))2.871 7,雌鱼生长快于雄鱼,且寿命更长。研究认为:北江鲂资源呈现低龄化的趋势,为可持续开发利用,建议限定捕捞规格为300 mm(700 g)以上。

黄鳝肠道细菌及产酶菌株的研究

从健康的黄鳝肠道中分离出细菌32株。革兰氏染色结果表明,8株为革兰氏阳性菌,24株为革兰氏阴性菌。研究了其产蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶的能力。结果表明,有53.13%的菌株能分泌蛋白酶,43.75%的菌株能分泌脂肪酶,34.38%的菌株能分泌淀粉酶,21.88%的菌株能分泌纤维素酶。其中产4种酶的有1株,产3种酶的有5株,产2种酶的有9株,产1种酶的有12株,不产酶的仅有5株。产酶菌株的比例高达84.38%。