康宁木霉K801纤维素酶cbh2基因的克隆及序列分析

通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增得到纤维素高产菌株康宁木霉Trichoderma k■ningii K801纤维二糖水解酶（CBHII）基因全序列，并克隆到pGEM-Teasy Vector。序列分析表明，所克隆的cbh2基因长1611bp，包含了纤维二糖水解酶基因的完整编码区序列，并含有三个真核生物典型的内含子序列，其中四个外显子序列共同编码一个471aa的蛋白质。该序列是国内首次克隆得到的cbh2编码区全序列，与国外报道的T. reesei已知序列的同源性达到99.89％,只有两个碱基差别，而推测的氨基酸序列只有一个位置疏水性氨基酸之间发生替代，在推测的氨基酸序列上发现3个潜在的N-糖基化位点。

纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件研究

本研究通过γ射线照射和亚硝基胍交替处理 ,诱变出一株纤维素酶高产菌株T80 1 ,与出发菌株相比 ,其产酶能力提高 1 77倍。通过对诱变菌株产纤维素酶条件研究发现 ,以稻草粉为碳源、蛋白胨为氮源时 ,菌株产酶最高。该菌株产酶最适培养温度为 2 8℃～ 30℃ ,最适培养 pH为 4 8～ 5 0 ,在此条件下发酵五天达到产酶高峰。该诱变株产酶能力高于国内外一些已知的纤维素酶高产菌株如QM941 4等 ,具有重大的实用价值。

耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究

从木聚糖酶高产短小芽孢杆菌 (Bacilluspumilus)BP5 1中克隆得到木聚糖酶基因xynA ,将其构建在芽孢杆菌表达载体pWH1 5 2 0中得到重组质粒pWSX1 1。xynA由木糖诱导xylA启动子调控xynA表达。采用同源高效表达策略 ,以原生质体转化方法将pWSX1 1转回原始菌株BP5 1中 ,获得重组菌株BPX1 1。通过木糖诱导重组菌株中的xy nA基因高效分泌表达 ,使木聚糖酶产酶活力比原菌株BP5 1提高了 87% 。

酿酒酵母海藻糖-6-磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株AS2 1 41 6中分离纯化出总RNA和mRNA ,以AMV逆转录酶合成cDNA ,采用保守引物 ,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因 ,对该基因的全序列分析表明 ,该基因含有 1 50 7个核苷酸 ,与国外报道相关基因的同源性达 99 6%。利用BamHⅠ和SacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体 pBin438多克隆位点上 ,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。

一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离、鉴定及系统发育分析

从土壤微生物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖苷酶的菌株YW2 1 1 2 ,该酶能特异性水解神经节苷脂中连接神经酰胺和寡糖链之间的糖苷键 ,是研究神经节苷脂结构与功能的重要工具酶。对分离菌株YW2 1 1 2进行了形态、生理生化鉴定及 1 6SrDNA序列分析。菌株YW2 1 1 2为细菌 ,革兰氏染色阴性 ,直杆状 ,鞭毛周生 ,菌体大小为 ( 0 6μm～ 1 μm)× ( 1 μm～3μm) ,V -P实验阳性 ,甲基红阴性 ,利用葡萄糖产酸产气。以 1 6SrDNA同源性为基础构建了包括 1 1株相关种属细菌在内的系统发育树 ,在系统发育树中 ,分离菌株YW2 1 1 2与Enter obactercloacae在同一分支 ,二者的序列相似性为 98 6% ,结合形态和生理生化鉴定 ,将其鉴定为阴沟肠杆菌 (Enterobactercloacae)。

黑曲霉木聚糖酶在工业酒精酵母中的分泌表达

用重叠延伸PCR方法从黑曲霉 (Aspergillusniger)UV 11的基因组DNA中克隆出木聚糖酶的cDNA基因 ,构建了由酵母乙醇脱氢酶 (ADH1)启动子和终止子引导表达、木聚糖酶自身信号肽引导分泌、rDNA序列介导的酵母整合型分泌表达质粒pAX2。用pAX2与酵母YEp型G4 18抗性质粒共转化野生型工业酒精酵母S .cerevisiae 2 346 ,获得了整合型分泌表达木聚糖酶的酵母重组菌株XY2。

疾病个性化诊断相关的转化医学尝试

转化医学是一种新的生物医学研究和应用模式,强调"从床旁到实验室再到床旁"的联接,通过将基础医学研究成果转化为临床应用的工具,使其在疾病预防、诊断、个体化治疗和预后等各个环节发挥重要作用。清华大学利用自身在生物芯片、系统生物学、化学、微电子工程、精密仪器等方面的学科优势,从临床医院的实际需求出发,通过实验室研究提出解决方案,再与生物医学企业合作将科研成果转化为产品,最后将产品回馈应用于临床,探索出一条从"临床需求-高校研发-企业转化-临床应用"的成功途径。经过近十年的实践,目前已有部分科研产品获得成功转化并应用到遗传病诊断、感染性疾病诊断、自身免疫性疾病诊断、肿瘤早期诊断和转移评价、辅助生殖、生物医学仪器研制等众多领域。

基于国产微滴数字PCR的SNP快速检测技术研究

目的 在法医学领域,现有的SNP检测主要依赖进口,检测工作量大、耗时长且成本较高。微滴数字PCR (droplet digital PCR,ddPCR)作为新一代的PCR技术,可以快速检测低浓度样本DNA,且有较强的抗干扰能力。本研究旨在国产ddPCR平台建立SNP分型检测体系并对其性能进行评估,以探讨ddPCR技术在法医学检验领域的应用价值。方法 在ddPCR平台建立高原适应性EPAS1单倍型(rs115321619、rs73926263、rs73926264、rs73926265和rs55981512)检测体系,测试各位点引物探针特异性,对体系的准确性、稳定性、灵敏度、检材适应性进行评估,并比较了ddPCR和SNaPshot微测序检测体系的抗抑制性,最后对样本地区来源进行测试。结果 ddPCR在2.5 h内即可快速获取检测结果,体系准确性和稳定性好,检测灵敏度为0.312 5 ng,且抗抑制性能力突出。70份测试样本检测结果与背景信息一致。结论 基于ddPCR的SNP检测体系具有准确可靠、简便快速、抗抑制能力强等优势,在法医学快速检验领域有较强的应用潜力,适合法医现场检验需求。