油茶SRAP标记的PCR体系建立与优化

油茶是我国主要的木本食用油料树种,拟建立油茶新型SRAP标记(序列相关扩增多态性)的优化PCR体系。以油茶优良品种的总DNA为材料,分析了影响油茶SRAP-PCR的主要参数,包括模板DNA量、引物浓度、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、退火温度6个因素的影响,建立了适合油茶SRAP-PCR的优化体系为:20μL的PCR反应体系中,2.0μL 10×PCR buffer,2.0 mmol/L Mg2+,225μmol/L dNTPs,0.6μmol/L引物,30 ng模板DNA和0.75 U Taq DNA聚合酶;最佳PCR循环条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5循环;94℃变性1 min,52℃复性1 min,72℃延伸1 min,35循环;最后72℃延伸10 min;4℃保存。本研究结果可为今后利用SRAP这一新型标记技术进行油茶分子遗传学与标记辅助选择育种研究打下基础。

绵毛优若藜冷胁迫均一化全长cDNA文库的构建

以绵毛优若藜叶片和嫩茎为材料，对盆栽的绵毛优若藜小苗进行梯度低温胁迫处理后，采用SMART（switching mechanism at 5’end of RNA transcript）与DSN（duplex-specific nuclease）均一化相结合技术构建绵毛优若藜冷胁迫均一化全长cDNA文库。经测定，原始文库的库容量为1．4×10^6pfu。PCR检测结果显示：插入片段的长度在0．5～3kb之间，平均大于1kb，表明文库构建效果较好。该文库包含有大量的未知基因，有待进一步的发掘和研究。

黑麦草抗冻蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

对多年生黑麦草进行冷胁迫处理后,提取叶片总RNA,采用RT-PCR法获得了LpAFP成熟蛋白的cDNA克隆。序列分析结果表明,该成熟蛋白的开放读码框(ORF)长度为357 bp,编码一条由118个氨基酸组成的多肽。生物信息学分析结果表明,黑麦草成熟抗冻蛋白与其他植物抗冻蛋白的同源性较低,与鱼类抗冻蛋白和昆虫抗冻蛋白则没有同源性。