b型流感嗜血杆菌多糖ELISA检测方法的建立

目的建立b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)多糖(Polyribosylribitolphosphate,PRP)的ELISA检测方法。方法用灭活的Hib菌免疫家兔,1周免疫4次,共免疫6周,采血,检测血清抗体滴度。对兔免疫血清进行非特异性抗体免疫吸附,纯化兔抗PRP抗体,用纯化的兔抗PRP抗体包被酶标板,HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法检测PRP。确定标准曲线的最佳线性范围,并对方法进行特异性、准确性和精密性验证。结果兔免疫血清的抗体效价可达1∶2 800。该方法的线性检测范围为0.030～0.500 ng/ml,检测限为0.030 ng/ml。该方法检测大肠杆菌上清蛋白、牛血清白蛋白、LB培养基及破伤风-乙脑结合疫苗均无特异性反应;检测0.500、0.250、0.150 ng/ml的PRP标准品试验内变异系数(CV)在1.16%～2.40%之间,回收率在93.2%～107.2%之间;试验间CV在1.57%～4.11%之间,回收率在101.3%～101.6%之间。结论该方法特异性、准确性和精密性均较好,可以特异性检测b型流感嗜血杆菌多糖。

靶向人表皮生长因子受体3治疗性单克隆抗体的制备及筛选

目的制备并筛选靶向人表皮生长因子受体3(human epidermal growth factor receptor 3,Her3)的单克隆抗体。方法用CHO系统克隆表达Her3的胞外区,获得重组蛋白h GH-Her3-ECD,用该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,并经常规细胞融合杂交瘤技术制备单克隆抗体。对制备的单克隆抗体进行抑制Her3与其配体HRG的结合试验、亲和力测定、亚型鉴定、结合抗原结构域的确定、识别肿瘤细胞表面Her3抗原的FACS分析及对A431细胞增殖抑制分析。结果获得100多株靶向Her3的单克隆抗体,其中927、1002、1050、993、1044、1056株具有较强的抑制Her3与HRG结合活性,均为Ig G1型,亲和力较好。927、1002、1050株与Her3第Ⅰ结构域结合,993、1044、1056株与Her3第Ⅲ结构域结合,均能结合A431和Bx Pc3表面的Her3分子,可明显抑制A431细胞的增殖。结论获得的靶向Her3单克隆抗体基本满足开发治疗性单抗的要求,具有成为治疗性单克隆抗体的潜在条件。

阻断型抗人IgE单克隆抗体的制备及其表位分析

目的利用基因重组抗原免疫小鼠，制备抗人IgE单克隆抗体，研究其特异性和功能。方法用表达的重组人IgE-Fc免疫BLAB／c小鼠，取其脾细胞与Sp2／o细胞融合，以间接ELISA法筛选杂交瘤上清。用ELISA阻断分析鉴定其生物学功能；通过丙氨酸突变扫描分析确定其抗原表位。结果利用杂交瘤技术获得了1株抗人IgE的单克隆抗体178，它具有IgE抗体特异性反应，其识别的抗原表位位于IgE与其受体结合的关键部位。经鉴定其具有体外阻断IgE与其受体结合的活性。结论利用基因重组抗原制备了1株抗人IgE的单克隆抗体178，此单克隆抗体具有体外阻断IgE与其受体结合的生物活性。

利妥昔单抗及其生物类似药的杂质分析

目的 对利妥昔单抗原研药和类似药的产品相关杂质和工艺相关杂质进行分析.方法 用分子排阻高效液相色谱法（size-exclusion high-performance liquid chromatography,SE-HPLC）、毛细管电泳和离子交换高效液相色谱法（ion-exchange high-performance liquid chromatography,IEX-HPLC）对原研药和类似药的产品相关杂质进行分析.同时对类似药的电荷异质体进行纯度和生物活性鉴定.采用ELISA和定量PCR对原研药和类似药的工艺相关杂质进行分析.结果 SE-HPLC分析表明,原研药和类似药中抗体单体分别占98.9％和99.9％,聚合体分别占1.0％和0.1％.毛细管电泳显示,原研药中相对分子质量低的杂质占5.6％,类似药中占3.3％;原研药和类似药中非糖基化重链均占0.6％.IEX-HPLC分析表明,原研药酸性峰和碱性峰含量分别为21.0％和10.0％,类似药分别为17.7％和9.1％.类似药主峰组分的纯度和补体依赖的细胞毒性均高于酸性峰组分和碱性峰组分.原研药和类似药中的宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA及蛋白A的残留量相似,且大多低于检测限.结论 利妥昔单抗原研药和类似药产品相关杂质和工艺相关杂质的类别和水平相似.

抗HER3单克隆抗体的人源化及成药性初步评价

目的构建人源化抗人表皮生长因子受体3(human epidermal growth factor receptor 3,HER3)单克隆抗体(单抗)并对其成药性进行初步评估。方法通过互补决定区(complementarity-determining region,CDR)移植对鼠抗HER3单抗进行人源化,然后对骨架区一些位点氨基酸进行回复突变以恢复人源化抗体的亲和力。对重组表达的人源化抗体用聚乙二醇沉淀法检测其在不同缓冲液中的溶解度,并通过测定内源荧光评估其高级结构。结果经CDR移植及回复突变的抗HER3人源化抗体具有与嵌合抗体相当的亲和力,且人源化抗体具有较好的溶解度及典型的抗体内源荧光特性。结论成功人源化了鼠抗HER3单抗,人源化后的抗体具有开发成临床药物的潜力。

G17-白喉毒素嵌合蛋白的表达、纯化和免疫原性初步研究

目的构建胃泌素多肽G17-白喉毒素A亚单位(diphtheria toxin subunit A, DTA)嵌合蛋白,并初步研究其免疫原性。方法用酶切法将编码G17的基因与DTA基因连接后,插入载体pET11C,并在大肠埃希菌BL21中表达。先后用阴离子交换色谱法和分子排阻色谱法对表达的目的蛋白进行纯化。用纯化的G17-DTA免疫NIH小鼠,并用ELISA检测小鼠抗G17抗体。结果构建的G17-DTA嵌合蛋白可在大肠埃希菌中高效表达,表达量达0.5~0.6 mg/ml菌液。经2次纯化后,G17-DTA的纯度可达95%。纯化的G17-DTA在小鼠中诱生了抗G17抗体。结论构建的G17-DTA嵌合蛋白能在大肠埃希菌中表达,而且在小鼠中具有免疫原性。