靶向CD99的CAR-T细胞扩增优化研究

背景与目的:嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞疗法对血液和淋巴系统肿瘤的治疗效果显著,但对实体瘤效果较差,这与靶点选择的因素有关。针对尤因肉瘤(Ewing sarcoma,ES),CD99可作为CAR-T细胞潜在的靶点。由于T细胞自身表达CD99蛋白,靶向CD99的CAR-T细胞存在体外扩增能力有限的问题。本研究旨在通过增加CD99敲低的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)、优化慢病毒转导的感染复数(multiplicity of infection,MOI)、筛选培养CAR-T细胞的培养基及培养容器,以获得CD99 CAR-T细胞制备的最优条件。方法:筛选shRNA序列,提高CD99 CAR-T细胞的扩增能力。采用不同的MOI、培养基和培养容器,分别检测在不同条件下CAR-T细胞的转导效率、细胞存活率、增殖能力、特异性杀伤能力及干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)释放水平等,筛选出最优的细胞制备条件。结果:通过shRNA敲低得到的KO-CD99 CAR-T细胞扩增水平显著高于CD99 CAR-T细胞[(16.40±0.40)vs(6.33±1.53),P<0.01]。转导MOI为0.25~1.0、培养基为OptiVitro时细胞的扩增效果最优。在透气瓶中培养的CAR-T细胞扩增倍数显著高于在培养袋中培养的细胞[MOI=0.25:(50.23±3.32)vs(13.02±4.82);MOI=0.50:(49.96±0.83)vs(18.25±2.88);MOI=1.00:(48.27±5.08)vs(13.16±6.26);P<0.01],且细胞分型更优、特异性杀伤更高。结论:通过shRNA技术得到的KO-CD99 CAR-T细胞可实现稳定扩增。从扩增条件优化结果看,MOI为0.25~1.00,培养基为OptiVitro,培养容器为透气瓶的条件下,KO-CD99 CAR-T细胞可获得更优的扩增能力、更多比例的记忆T细胞,为后续开展CD99 CAR-T细胞治疗ES的临床试验奠定了坚实基础。

缩氨基硫脲类化合物D331对人肺癌A549细胞的抑制作用及机制

目的研究缩氨基硫脲类化合物双-2-吡啶基酮缩氨基硫脲(D331)对人肺癌A549细胞的抑制作用,为该类化合物治疗肺癌提供初步依据。方法首先合成了双缩氨基硫脲类化合物D331,采用细胞锥虫蓝染色法和碘化丙啶(PI)染色法测定A549细胞生长情况,并用流式细胞仪检测了细胞周期变化,Hoechst33342染色及Annexin-Ⅴ与PI双染检测细胞凋亡,Western印迹法检测A549细胞给药处理24 h后低氧诱导因子(HIF1A)蛋白的表达情况。结果 15μmol/L D331抑制A549细胞生长,而30μmol/L D331可导致A549细胞凋亡。30μmol/L的D331处理细胞24 h会引起细胞HIF1A蛋白水平的上升,而D331与HIF1A抑制剂2-甲氧基雌二醇(2-ME)联用,可增强D331导致的细胞死亡。结论 D331对人肺癌A549细胞有良好的抑制作用,其作用机制可能与调节细胞周期变化和细胞凋亡有关。

机械搅拌式生物反应器悬浮培养293T细胞生产慢病毒的工艺

采用L型大泡通气系统机械搅拌式生物反应器培养293T悬浮细胞和规模化生产慢病毒载体,通过4种方法驯化293T悬浮细胞,对其慢病毒包装能力进行验证,并建立种子扩增链,在5.5 L工作体积生物反应器中绘制悬浮细胞生长曲线和包装慢病毒。结果表明,采用体积分数50%的293 CD05 Medium无血清基础培养基和体积分数50%的SMM293-TⅡ培养基可以快速驯化293T细胞,成功得到野生型且具有慢病毒包装能力的悬浮细胞系。悬浮细胞在机械搅拌式生物反应器培养,2 d细胞密度可达1.5×106个·mL^(-1)。添加质粒复合物和补料培养基,培养4 d可以收获6.5×107 TU·mL^(-1)滴度的慢病毒粗产品,相比细胞工厂的滴度提高34倍。

CAR-T制备工艺中PD-1表达的动力学研究

目的研究嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)制备工艺中抗CD3/CD28磁珠和慢病毒对T细胞中程序性死亡因子1(PD-1)蛋白表达的影响,为改善其体内抗肿瘤活性研究提供理论依据。方法筛选高表达PD-1细胞系,添加CAR-T制备工艺中抗CD3/CD28磁珠和慢病毒(CAR-GFP、CAR-CD19、CAR-CD30),流式细胞术检测T细胞系PD-1蛋白的变化。利用PD-1刺激剂研究CAR-T制备中PD-1的表达。结果流式细胞分析显示,抗CD3/CD28磁珠和CAR-CD30慢病毒能显著刺激Jurkat中PD-1蛋白表达[(63.5±4.9)%和(63.0±5.3)%,P<0.01]。Jurkat添加0.5∶1抗CD3/CD28磁珠刺激后,PD-1表达量在48 h为最大值,之后随时间增加PD-1蛋白表达下降,144 h时下降到(4.5±0.3)%以内。CAR-CD30慢病毒以MOI=3感染复数刺激Jurkat后PD-1蛋白表达比较稳定。T淋巴细胞中添加抗CD3/CD28磁珠能提高约3倍PD-1的表达。结论低浓度抗CD3/CD28磁珠能短暂性刺激T细胞中PD-1蛋白表达且不影响其活率。