结核病疫苗研究进展与突破

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的严重危害人类健康的慢性传染性疾病,其中以肺结核最为多见。卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)系目前唯一可用的预防结核病的疫苗,在全球范围内被广泛接种,其对预防婴幼儿结核病发挥重要作用,但由于远期保护力不足,且对结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)人群不能发挥预防作用,对预防全社会MTB传播效果有限。因此,全球科学家运用多种技术手段,积极研究不同技术路径的结核病新疫苗。作者从经典疫苗BCG出发,系统梳理了目前国内外结核病新疫苗的最新研究进展,并从抗原筛选研究、创新疫苗技术平台及精准免疫思路等方面阐述了结核病疫苗研究的新突破,以期为后续开展结核病相关疫苗研究提供有价值的参考。

近红外荧光成像监测ENO1 mAb在宫颈癌荷瘤小鼠体内生物分布的研究

本研究探讨近红外荧光成像(NIRF)观察烯醇化酶1(ENO1)单克隆抗体(mAb)在宫颈癌荷瘤小鼠体内的分布、代谢及肿瘤靶向效率。利用癌症基因组图谱分析ENO1的表达与肿瘤分期和预后以及肿瘤免疫浸润的关系;Cy7-NHS和FITC与ENO1 mAb偶联成Cy7-ENO1 mAb和FITC-ENO1 mAb,通过激光共聚焦显微镜验证ENO1 mAb在宫颈癌细胞TC-1的定位,并建立宫颈癌皮下肿瘤模型,尾静脉注射Cy7-ENO1 mAb后在1、6、24、48、72和120 h进行近红外荧光成像,成像24 h后迅速解剖主要脏器进行体外成像。生物信息学分析结果表明ENO1在正常宫颈组织与宫颈癌组织中的表达有显著差异,免疫组织化学(IHC)结果提示ENO1蛋白在宫颈癌组织中高表达;此外,其表达与肿瘤分期和淋巴结分期显著相关,并且ENO1的高表达与多种糖酵解酶相关;激光共聚焦显微镜扫描显示FITC-ENO1 mAb能特异性结合在TC-1细胞膜表面,细胞未见内化;近红外荧光成像证明Cy7-ENO1 mAb主要富集在肝脏、肾脏和肿瘤组织,并且具有较高的肿瘤靶向效率。NIRF成像可以实时、动态监测ENO1 mAb在宫颈癌荷瘤小鼠体内的分布,其代谢器官主要是肝脏和肾脏,并且证实ENO1 mAb具有靶向宫颈癌作用。

小檗碱对结核抗原持续刺激致T细胞耗竭的干预作用

目的探究小檗碱对结核分枝杆菌抗原持续刺激致T细胞耗竭的影响。方法应用结核抗原持续刺激小鼠模拟临床结核分枝杆菌慢性感染病理过程:卡介苗感染C57BL/6小鼠1周后,使用结核抗原ESAT6-CFP10(EC)和Mtb10.4-HspX(MH)持续刺激4次,每次间隔1周,建立T细胞耗竭模型。利用该模型进行干预治疗:结核抗原刺激期间每天给予不同剂量小檗碱灌胃治疗,末次抗原刺激后1周,流式细胞术检测抗原特异性T细胞分泌γ干扰素的水平和脾脏CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞表面抑制性受体PD-1的表达;ELISA检测血清中γ干扰素的水平;生化试剂盒检测脾脏淋巴细胞糖酵解代谢产物丙酮酸和乳酸的浓度;小檗碱体外作用于Jurkat T细胞后检测丙酮酸和乳酸的浓度。结果结核抗原持续刺激致抗原特异性T细胞分泌γ干扰素的水平降低(P<0.05),CD4^(+)和CD8^(+)T细胞表达PD-1增多(P<0.05),提示发生T细胞耗竭。不同剂量的小檗碱治疗后,减弱了T细胞的持续活化,血清γ干扰素水平降低(P<0.01),CD4^(+)和CD8^(+)T细胞PD-1表达减少(P<0.05)。体外实验表明小檗碱抑制Jurkat T细胞的糖酵解(P<0.01)。结论结核抗原持续刺激诱导T细胞耗竭,而小檗碱治疗可抑制T细胞的糖酵解,调节T细胞活化,预防T细胞耗竭。

结核分枝杆菌蛋白亚单位疫苗与疫苗诱导的T细胞免疫记忆研究进展

牛分枝杆菌减毒活疫苗——卡介苗(bacillus Calmette-Gurin,BCG)对预防严重的儿童结核病有效,但其免疫保护效率随儿童年龄增长而降低。BCG不能提供终身免疫保护可能与其诱导的记忆性T细胞主要是寿命较短的效应记忆性T细胞有关。新型结核分枝杆菌蛋白亚单位疫苗将有效的抗原有机组合起来,在适宜的疫苗佐剂辅助下诱导Th1型免疫应答。动物实验表明,增加抗原谱可有效提高亚单位疫苗的保护效率。更重要的是,亚单位疫苗在体内持续时间较短,可诱导寿命较长的中央记忆性T细胞,提供比BCG更持久的免疫保护力。记忆性T细胞的分化受抗原特性与剂量、细胞因子、转录因子及雷帕霉素等的调控。对亚单位疫苗及其诱导的免疫记忆进行研究将对新型结核分枝杆菌疫苗的设计与评价产生积极影响。

卡介苗增强人β-防御素-1基因在肺腺上皮细胞表达的分子调节机制

目的 研究人 β-防御素 - 1(h BD- 1)基因启动子结构及卡介苗胞壁蛋白增强其 m RNA在肺腺上皮细胞 (SPC- A- 1)中表达的转录调控机制。方法 h BD- 1基因 5′-端上游序列被连接入无启动子的 p EGFP- 1质粒和p CAT basic质粒 ,构建了系列 5′-端缺失的 p EGFP h BD- 1及 p CAT h BD- 1报告质粒。p EGFP h BD- 1质粒转染细胞后用荧光倒置显微镜观察绿色荧光表达强度。 p CAT h BD- 1报告质粒和 p SV- β- Galactosidase control质粒 (内对照 )共转染 SPC- A- 1细胞后 ,给予卡介苗胞壁蛋白活性组分刺激 ,用 EL ISA检测 CAT和 β- Gal浓度。结果 h BD-1基因上游 - 314段有较强的启动子活性 ,- 6 9段则启动活性减弱 ;BCG刺激后 ,即使上游序列缩短至 - 6 9位点时 ,报告基因 CAT相对表达量仍明显增高。该区域有一同源性极高的 C/ EBPβ(CCAAT/ Enhancer- binding proteinβ)结合元件。结论 h BD- 1基因上游 - 314 bp段具有较完整的启动子活性 ,其中含有 C/ EBPβ结合位点的 - 6 9/ +5 4 bp序列介导卡介苗对 h BD-

铁筷子多糖抑瘤效应及对荷瘤机体抗氧化活性的实验观察

在动物模型上观察了铁筷子多糖 (HFPS)对实体型S1 80肉瘤生长的抑制效应 ,在光学显微镜下对比了局部肿块中癌细胞的生长特征 ,并用生化方法对各组动物血SOD、GSH -Px活力及MDA含量进行了检测。结果表明 ,HFPS具有确定的抑制S1 80生长的作用 ,机制可能与其提高抗氧化酶活性 。

细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗的构建

目的构建细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗(rsBCG-Eg95)。方法分别以卡介苗BCG基因组DNA和pGEX-4T-Eg95重组质粒为模板,PCR扩增获117bp的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和471bp的Eg95基因序列。将这两个序列定向克隆至大肠埃希菌-BCG穿梭质粒pMV261,经酶切、PCR扩增及测序鉴定得到重组质粒pSMEg95。电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rsBCG-Eg95疫苗,卡那霉素抗性基因筛选并经PCR扩增鉴定。结果质粒pSMEg95经双酶切、PCR扩增及测序鉴定,证实克隆基因Ag85B信号肽和Eg95基因序列正确插入载体pMV261,并将此重组质粒导入BCG菌,经PCR扩增鉴定证实细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗(rsBCG-Eg95)构建成功。结论构建了含有BCG信号肽Ag85B和保护性抗原Eg95基因序列的细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗rsBCG-Eg95。

ABCG2与CD133在宫颈癌的表达及意义

目的:探讨ABCG2及CD133蛋白在宫颈癌的表达及临床意义。方法:用免疫组化SP法检测92例宫颈癌、40例宫颈上皮内瘤变(CIN)和30例正常宫颈组织中AB-CG2及CD133蛋白的表达。结果:ABCG2在宫颈癌、CIN和正常宫颈组织的阳性表达率分别为69.6%、42.5%、23.3%,CD133为57.6%、37.5%、23.3%,两者在宫颈癌的表达均高于CIN及正常组织,差异均有统计学意义(P<0.05);两者表达与宫颈癌患者年龄、肿瘤大小、临床分期无相关性(P>0.05),而在不同分化组间表达的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:ABCG2和CD133蛋白异常表达与宫颈癌的发生、发展有关,二者联合检测可作为评估宫颈癌恶性程度、指导治疗的重要参考指标。

分枝杆菌所致家兔皮肤液化病理模型研究

目的建立卡介苗(BCG)、H37Ra和耻垢分枝杆菌感染的新西兰兔皮肤模型,为肺结核干酪样坏死和继而发生的液化提供研究模型。方法新西兰兔皮内分别注射BCG、H37Ra和耻垢分枝杆菌的5×106CFU、5×104CFU、5×102CFU/ml菌液,6周后在病灶周围再次以相同剂量皮内注射,14d后病变明显时取材,制作切片,行HE染色,显微镜下观察。结果新西兰兔分别经皮内接种BCG、H37Ra或耻垢分枝杆菌后,高剂量组观察到明显的炎症反应和脓肿液化、破溃等改变。再次免疫可观察到郭霍现象。引起病变的严重程度依次为BCG强于H37Ra,后者又强于耻垢分枝杆菌。显微改变可具典型的结核结节样病灶。皮肤模型处取材,行细菌抗酸染色,结果阳性。BCG中、低剂量组再次免疫可诱导小结节样病变,但不发生液化溃疡,其余中剂量组及低剂量组没有观察到明显改变。结论BCG、H37Ra和耻垢分枝杆菌均可引起皮肤干酪样坏死和液化,病理损伤与感染细菌剂量密切相关,5×106CFU/ml浓度的分枝杆菌可有效诱导液化和坏死,其中BCG引起的病理改变最明显。

结核分枝杆菌基因分型方法及其应用

结核分枝杆菌基因分型是监测结核病流行和传播的有效手段．用于结核病流行病学研究的分型方法已有很多种，但不同的基因分型方法各有特点，应根据不同的研究目的选择合适的方法，或者多种方法结合使用，并结合传统的流行病学资料综合分析可得出可靠结论。结核分枝杆菌分型鉴定技术在研究结核分枝杆菌菌种鉴定、耐药和耐多药检测，以及结核病的病原演变、跟踪和确定传染源、确定流行病学事件、揭示疾病传播机制等方面发挥着重要的作用。同时，此类研究正与新兴的遗传信息学相结合，相应成果能够为更科学地制定结核病防控策略提供依据。

HBsAg阳性孕妇免疫接种阻断HBV宫内感染疗效的Meta分析

目的评价HBsAg阳性孕妇产前应用乙肝免疫球蛋白（HBIG）或联用乙肝疫苗阻断胎儿HBV宫内感染的有效性及安全性。方法计算机检索6个数据库,手检9种期刊,并追查参考文献,纳入国内外符合纳入标准的随机对照试验和半随机对照试验,由两名评价员独立筛查文献,评价质量和提取资料。用Revman 4.2.10软件分析数据。采用χ2检验鉴定研究间异质性,使用固定效应或随机效应模型合并结果。结果HBsAg阳性/HBsAg和HBeAg均阳性孕妇孕期应用HBIG总剂量600 IU,胎儿HBV宫内感染率〈空白对照组（RR=0.42,95%CI=0.21-0.83,P=0.01）,新生儿HBV DNA阳性率低于空白对照组（RR=0.30,95%CI=0.10-0.85,P=0.02）,新生儿HBeAg阳性率Anti-HBs阳性率与空白组比较差异无统计学意义;总剂量大于600 IU时,宫内感染率〈空白对照组（RR=0.39,95%CI=0.26-0.58,P〈0.000 01）,新生儿Anti-HBs阳性率与对照组比较差异无统计学意义。HBsAg和HBeAg均阳性孕妇孕期应用HBIG总剂量〉600 IU,胎儿HBV宫内感染率、新生儿HBeAg阳性率、新生儿HBV DNA阳性率、新生儿Anti-HBs阳性率与对照组比较差异均无统计学意义;总剂量600 IU组新生儿HBeAg阳性率和新生儿HBV DNA阳性率与对照组比较差异有统计学意义。结论HBsAg阳性/HBsAg和HBeAg均阳性孕妇孕期应用HBIG可降低胎儿HBV宫内感染率;HBsAg和HBeAg均阳性孕妇孕期应用HBIG阻断宫内感染的疗效尚不清楚。

结核病免疫机制及疫苗研究进展

结核病是一种棘手的重大传染病。虽然存在一些有一定疗效的治疗药物,亦有预防性疫苗———卡介苗(BCG);但结核病仍在世界范围流行,且发病率和病死率居高不下。结核病的免疫病理机制及疫苗研究近年来取得了一定的进展。结核分枝杆菌通过Toll样受体(TLR)等模式识别受体,激活巨噬细胞的天然免疫反应,清除细菌和调节获得性免疫反应。包括主要组织相容性复合物(MHC)限制的CD4+和CD8+T细胞,以及CD1限制的T细胞和γδT细胞参与抗结核获得性免疫反应,其中记忆性T细胞与调节性T细胞具有重要的免疫调节作用。但是,人们对结核病发生机制的认识仍然不足,限制了对结核病治疗药物和新型疫苗的研发。由于BCG对成人缺乏有效的保护力,故研制新型的结核疫苗是预防结核病的当务之急。当前处于实验阶段的候选疫苗包括重组BCG、减毒结核分枝杆菌和可用于加强BCG的亚单位疫苗,后者又包括痘苗病毒载体疫苗、核酸疫苗、新型佐剂辅助的蛋白疫苗。目前可行的疫苗免疫策略主要是使用BCG或其他疫苗初次免疫,然后选择亚单位疫苗加强免疫。然而,疫苗的免疫策略、免疫剂量、免疫途径、强化免疫次数和免疫时机都有待研究。反映疫苗保护力的免疫指标不明确、很难确定哪类疫苗进入临床试验、缺乏临床试验场地、疫苗效果评价需要很长时间及耗资巨大,增加了结核疫苗研究的难度和风险。

结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(CFP21)的基因克隆、表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(Culture filtrate protein 21,CFP21)原核表达载体,获得CFP21蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,PCR扩增cfp21基因,质粒PET28a(+)为表达载体,构建PET28a(+)/cfp21质粒,转化入大肠埃希菌DH5α中,抽提质粒,PCR扩增,测序,转化到大肠埃希菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,并用His Bind蛋白纯化试剂盒纯化CFP21。结果构建、表达和纯化了CFP21,分子量约为24kD,主要以包涵体形式存在。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,纯化得到CFP21蛋白,为CFP21的进一步研究奠定基础。

体外分枝杆菌培养系统检测结核分枝杆菌耐受利福平的系统评价

用Meta-analysis方法评价非放射性分枝杆菌培养系统检测结核分枝杆菌耐受利福平的准确性。通过检索PubMed、EMBASE、CBMWeb、CSJD、CJFD数据库和其他方式广泛收集文献。用QUADAS(Quality Assessment of Diagnostic AccuracyStudies)标准评价文献质量。用Meta-Disc软件计算合并灵敏度、合并特异性和SROC曲线等评价非放射性分枝杆菌培养系统的诊断正确性。最终纳入6篇文献。非放射性分枝杆菌培养系统在检测结核分枝杆菌耐受利福平时,均显示了较高的灵敏度和特异性。MB/BacT系统的合并灵敏度=100%,合并特异性=99%。BACTEC MGIT960检测系统的平均灵敏度=100%,平均特异性=91%,SROC曲线下面积为0.997。结论:MB/BacT和BACTEC MGIT960系统在检测结核分枝杆菌耐药(利福平)性方面显示了较高的灵敏度和特异性。推荐使用MB/BacT和BACTEC MGIT960系统代替BACTEC460检测系统作为结核分枝杆菌耐药(利福平)性的确诊试验。限于纳入研究的局限性,手工操作的分枝杆菌生长指示管(MGIT)系统的检验效能还有待进一步研究。

结核分枝杆菌Rv2629基因产物的亚细胞定位和穿梭质粒转化耻垢分枝杆菌

目的研究结核分枝杆菌利福平耐药相关蛋白Rv2629在细胞内的亚定位及其与药敏的相关性。方法采用差速离心进行细胞组分分离及蛋白质印迹法(Western blot)检测初步判定蛋白亚细胞定位;采用pMV261转化耻垢分枝杆菌,BACTEC MGIT960测定转化菌株的利福平耐受性。结果Rv2629蛋白主要定位于结核分枝杆菌的细胞壁和细胞膜,重组有Rv2629突变位点191C质粒的耻垢分枝杆菌对利福平的最低抑菌浓度(MIC)为160mg/L,相应的携带有野生型基因191A的宿主菌MIC为20mg/L。结论Rv2629基因191A/C突变同利福平耐药相关。

1例L型支气管戈登菌肺部感染的报道

放线菌目戈登菌属支气管戈登菌存在于环境中,在机体免疫力下降时可感染致病。从1例肺部感染4年的78岁患者痰标本中分离出1株菌株,经聚合酶链反应(PCR)扩增16SrRNADNA,序列比对分析证实为支气管戈登菌。该菌株在含蔗糖的Middlebrook7H9(7H9-L)半固体培养基上呈煎蛋样嵌入性生长,在含氯化钠的92-3TB(92-3TB-L)液体培养基也生长,而在罗氏培养基、BACTECMGIT-960、不含氯化钠的92-3TB(92-3TB-B)液体培养基及不含蔗糖的Middlebrook7H9(7H9-B)半固体培养基不生长。涂片抗酸染色显微镜下可见大小不等的抗酸染色阴性球状或短杆状菌。传代培养2代后可见橘红色菌落,涂片抗酸染色可见少量抗酸染色弱阳性杆状菌,革兰染色及扫描电子显微镜观察菌体为杆状。结果表明,从患者痰液中分离的菌株为L型支气管戈登菌,提示肺部感染迁延不愈的免疫力低下患者需考虑感染L型支气管戈登菌的可能。

奶牛子宫内膜粘液抗菌肽的分离纯化

为研发奶牛抗菌肽生物制剂,防治奶牛子宫内膜炎,本研究采用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖弥散法检测子宫内膜粘液酸溶性提取物抗菌活性;应用琼脂糖电泳及水平电泳洗脱分离相应的抗菌条带,HPLC进一步分离纯化,琼脂糖弥散法检测纯化分子抗菌活性,Tricine-SDS-PAGE电泳检测其分子量。结果表明,从奶牛子宫内膜酸溶性提取物中纯化出一分子量约为14kD左右的抗菌多肽,对大肠杆菌(E.coliBL21)和金黄色葡萄球菌26003具有抗菌活性。本研究可能分离纯化出一种新的子宫内膜分泌的抗菌多肽,其可能参与奶牛子宫的天然防御机制。

高危型HPV E6、E7蛋白致宫颈癌的分子机制研究

对近年来高危型人乳头瘤病毒(HPV)E6、E7蛋白诱导宫颈癌发生的分子机制的研究进展进行了综述,为今后宫颈癌的防治提供思路。