人自噬相关蛋白ATG7的原核表达及纯化鉴定

目的:原核表达并纯化自噬相关蛋白ATG7,初步鉴定其生物学活性。方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人ATG7基因的编码序列,插入载体p ET-28a(+)得到重组质粒,经Bam HⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Rossate菌株进行小量诱导,纯化融合蛋白His-ATG7,通过Western印迹和SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果。结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约2031 bp的目的片段,插入载体p ET-28a(+)后构建出His-ATG7重组质粒,并经酶切鉴定及测序证实无误;转化大肠杆菌Rossate并进行小量诱导,纯化后SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为78×103的融合蛋白。结论:纯化得到原核系统表达的His-ATG7融合蛋白,为后续研究ATG7在自噬中的作用机制奠定了实验基础。

人自噬相关蛋白ATG5的原核表达及纯化

目的:原核表达纯化带His标签的自噬相关蛋白ATG5。方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人ATG5基因的编码序列,插入载体p ET-28a(+)中得到重组质粒,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Ros-sate进行小量诱导,挑选出可以诱导His-ATG5蛋白的菌液进行融合蛋白的纯化,通过Western印迹和SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果。结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约828 bp的目的片段,插入载体p ET-28a(+)构建出His-ATG5重组质粒并经酶切及测序验证;转化大肠杆菌Rossate后进行小量诱导表达并纯化蛋白,SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为38×103的融合蛋白。结论:原核表达并纯化获得His-ATG5融合蛋白,为后续研究ATG5在自噬中的作用机制奠定了实验基础。

miR-202在膀胱癌细胞中的表达水平及其对膀胱癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

【目的】探讨miR-202在膀胱癌细胞中的表达水平及其对膀胱癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。【方法】实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测膀胱细胞中miR-202的相对表达水平;转染技术将miR-202和miR-NC质粒转染至UM-UC-3细胞中,并设置为miR-202组和NC组。细胞增殖实验、细胞侵袭实验和凋亡实验分别检测两组细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡情况,比较两组裸鼠移植瘤体积和重量,Western blot实验检测两组细胞中PIK3CA蛋白的表达情况。【结果】膀胱癌细胞中miR-202的相对表达水平分别低于正常膀胱上皮细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-202组与NC组相比细胞的OD值、迁移和发生侵袭的细胞数降低,凋亡率增加,差异有统计学意义(均P<0.05)。miR-202组移植瘤的体积和重量均低于NC组,差异有统计学意义。miR-202组PIK3CA蛋白的表达低于NC组,差异有统计学意义。【结论】miR-202可能通过抑制PIK3CA蛋白的表达从而抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡。