结核分枝杆菌菌悬液光密度值与菌落计数的关联性

目的建立一种基于光密度值计算结核分枝杆菌菌落数的可靠方法。方法利用低频超声和玻璃珠研磨两种方法制备H37Ra菌悬液,菌悬液2倍梯度稀释后,分别测定各个稀释度菌悬液在600 nm处的光密度值（OD600值）,并分析OD600值与稀释倍数曲线,确定最佳的菌悬液制备方法,OD600线性范围,以及OD600值与CFU关联曲线。结果 OD600值为0.1～0.6,线性范围内OD600值与稀释倍数线性回归分析结果显示,玻璃珠研磨法和低频超声法相关系数（R2）分别为0.98、1.00,均呈良好的相关性,且低频超声法比玻璃珠研磨法的相关性好,其菌液分散更均匀。OD600值与CFU值线性回归分析结果显示,玻璃珠研磨法和低频超声法回归方程分别是：CFU=2.35×107×OD600＋4.42×105、CFU=3.26×107×OD600＋6.89×105。结论低频超声法是一种较好的结核分枝杆菌菌悬液制备方法,结合OD600值测定,可成为一种可靠、快速的结核分枝杆菌定量方法。

抗结核活性化合物HY-152E的作用靶点分析

抗结核活性化合物HY-152E是本实验室前期获得的具有良好抗结核活性并拥有授权专利(ZL201210088290.0)的小分子化合物(最低抑菌浓度≤0.09μg/m L)。为深入探索HY-152E的抗结核机制,本研究利用药物亲和反应靶点稳定性(drug affinity responsive target stability,DARTS)技术并结合蛋白质谱技术,分析可能与HY-152E相互作用的结核分枝杆菌潜在靶标蛋白。将结核分枝杆菌H37Ra的菌体蛋白裂解液与HY-152E共同孵育,用不同浓度的链霉菌蛋白酶消化30、45、60 min后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离并比较与HY-152E互作前后菌体蛋白耐受蛋白酶消化的差异条带,分别在相对分子质量70 000左右和45 000~55 000处观察到差异蛋白条带。利用蛋白质谱技术分析差异条带的蛋白信息,共获得86个蛋白信息。结合结核分枝杆菌数据库及蛋白功能信息,最终筛选到9个蛋白可能是HY-152E的抗结核作用潜在靶标。这些潜在靶标的确定,为后续研究HY-152E的抗结核分子机制奠定了基础。

乙酰化修饰调控结核杆菌异柠檬酸裂合酶的研究

目的:探索结核杆菌异柠檬酸裂合酶(ICL)蛋白322位点赖氨酸(Lys322)的乙酰化修饰对蛋白功能的调控作用。方法:构建结核杆菌ICL蛋白原核表达载体p ET28a-icl,并对Lys322位点进行定点突变为精氨酸(Arg,R)和谷氨酰胺(Glu,Q),体外表达纯化获得重组蛋白ICLWT、ICL322R和ICL322Q。通过Western blotting和酶活性测定来揭示Lys322位点突变前后对蛋白的乙酰化修饰水平及蛋白功能的影响。结果:Western blotting检测发现大肠杆菌表达体系获得的ICLWT、ICL322R和ICL322Q蛋白均有较高水平的蛋白赖氨酸乙酰化修饰信号,较ICLWT,ICL322R和ICL322Q突变蛋白的酶活性分别下降了大约50%和70%。结论:在大肠杆菌的表达体系中,ICL蛋白可以获得乙酰化修饰。ICL322Q突变蛋白酶活性的显著下降,揭示Lys322位点乙酰化修饰对ICL蛋白的功能存在负向调控。为未来深入探索赖氨酸乙酰化修饰对结核杆菌代谢,潜伏感染的调控作用奠定了基础。