HPLC-MS/MS法同时测定儿童血浆中万古霉素和地高辛的浓度

目的建立同时测定血浆中万古霉素和地高辛浓度的高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)法,并用于儿童患者治疗药物监测。方法血浆样本经甲醇沉淀蛋白前处理,分别以去甲万古霉素和地高辛-d3作为内标,采用EVO-C18色谱柱分离,流动相为水(含0.02%甲酸和2 mmol·L^(-1)乙酸铵)和甲醇,梯度洗脱,流速为0.55 mL·min^(-1)。质谱检测方式为ESI正离子模式,dMRM扫描。结果万古霉素在1~50μg·mL^(-1)与峰面积线性关系良好(R^(2)>0.991),地高辛在0.25~8 ng·mL^(-1)与峰面积线性关系良好(R^(2)>0.993)。方法准确度、精密度、基质效应和稳定性均符合要求,并成功应用于311个样本的测定。结论本方法操作简便、快速、灵敏度高,适用于人血浆中万古霉素和地高辛浓度的同时分析,可用于儿童患者临床治疗药物监测。

HPLC-MS/MS法同时测定微量血浆中甲氨蝶呤、左乙拉西坦、拉莫三嗪浓度及其临床应用

目的 建立HPLC-MS/MS法测定微量血浆中甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪的浓度,同时应用于儿童治疗药物监测。方法 取含药血浆10μl,用蛋白沉淀法对样本进行前处理。色谱柱为Agilent C18(50 mm×2.1 mm,1.8μm),流动相为0.1%甲酸水和甲醇,梯度洗脱;流速为0.4 ml/min。采用电喷雾离子源正离子模式,监测甲氨蝶呤m/z 455.1→308.2,甲氨蝶呤-D3 m/z 458.1→311.1(内标);左乙拉西坦m/z 171.1.4→126.2,左乙拉西坦-D6 m/z177.2→132.2(内标);拉莫三嗪m/z 256.1→211,拉莫三嗪-13C3-D3 m/z 262.1→217.1(内标)。结果 甲氨蝶呤在25~1 500 ng/ml线性关系良好,标准曲线方程:Y=0.251 6X+0.003 4(r=0.998 9),定量下限为25 ng/ml;左乙拉西坦在1~50μg/ml线性关系良好,标准曲线方程:Y=16.687 6X+0.000 2(r=0.991 1),定量下限为1μg/ml;拉莫三嗪在0.5~25.0μg/ml线性关系良好,标准曲线方程:Y=46.369 5X-0.059 9(r=0.999 1),定量下限为0.5μg/ml。样本批内、批间准确度和精密度符合要求、基质效应符合规定。本方法验证后成功用于1 348例临床患儿样本的检测。结论 本方法操作简便、专属性强、灵敏度高,可用于人血浆中甲氨蝶呤、左乙拉西坦及拉莫三嗪的分析,适用于儿童治疗药物监测。

HPLC-MS/MS法同时测定儿童微量血浆中达沙替尼和甲氨蝶呤浓度

目的建立液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法同时检测人血浆中达沙替尼和甲氨蝶呤浓度,并用于费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病患儿的治疗药物监测。方法分别以稳定同位素伊马替尼-D8和甲氨蝶呤-D3为内标,取10μL血浆样本经甲醇沉淀蛋白,采用Phenomenex Kinetex EVO C18(30 mm×2.1 mm,2.6μm)色谱柱分离,流动相为水(含0.05%甲酸)和乙腈,梯度洗脱;流速为0.5 mL·min^(-1),进样体积为1μL。质谱分析条件:电喷雾离子源正离子模式,多反应监测(MRM)扫描分析,离子通道分别为m/z 488.2→401.2(达沙替尼)和m/z 502.5→394.2(伊马替尼-D8);m/z 455.1→308.2(甲氨蝶呤)和m/z 458.1→311.1(甲氨蝶呤-D3)。结果达沙替尼的线性范围在0.5~200 ng·mL^(-1)(r>0.9900),定量下限(LLOQ)为0.5 ng·mL^(-1);甲氨蝶呤的线性范围在5~2000 ng·mL^(-1)(r>0.9900),LLOQ为5 ng·mL^(-1)。达沙替尼和甲氨蝶呤的批内与批间精密度、准确度、提取回收率、基质效应、稳定性均符合方法学要求。结论本方法操作简便、灵敏、准确,只需要微量血浆,适用于费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病患儿的治疗药物监测。

HPLC-MS/MS法快速测定儿童微量血浆中甲氨蝶呤和丙戊酸浓度

目的建立高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)法快速测定儿童微量血浆中甲氨蝶呤(MTX)和丙戊酸(VPA)的浓度。方法10μL血浆经甲醇沉淀蛋白后取上清液直接进样分析,内标为MTX-D3和VPA-D6;采用Phenomenex Kinetex C18柱(50 mm×2.1 mm,5μm)分离,以水(含0.01%甲酸)和甲醇为流动相,梯度洗脱,进样量5μL,流速0.5 mL·min^(-1),分析时长2.4 min。电喷雾离子源(ESI)正负离子切换扫描下,采用多反应监测(MRM)模式进行质谱分析,用于定量分析的离子对分别为m/z 455.1→308.2(MTX),143.2→143.2(VPA),458.1→311.1(MTX-D3)和149.2→149.2(VPA-D6)。结果MTX在31.25~2000 ng·mL^(-1)内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9995),定量下限为31.25 ng·mL^(-1);VPA在1.88~120μg·m L^(-1)内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9992),定量下限为1.88μg·m L^(-1);批内、批间准确度在98.05%~104.89%,批内、批间精密度的变异系数(CV)均≤6.73%,平均提取回收率为90.21%~100.55%,基质效应为93.22%~102.73%,溶血效应(溶血程度≤5%)不影响测定结果,血浆样品可分别在冻融3次、室温(25℃)24 h、4℃进样器12 h和冷冻(-20℃)30 d等条件下稳定保存;该法成功用于169例临床患儿血浆样本分析。结论本方法所需样本量小,快速、准确、灵敏、稳定,且不受溶血效应影响(溶血程度≤5%),可应用于儿童MTX和VPA治疗药物监测及联合用药研究。

孕酮抑制Aβ诱导星形胶质细胞活化所致神经元损伤

目的探究孕酮抑制Aβ诱导的星形胶质细胞活化,发挥神经元保护作用及其机制,为孕酮在阿尔采末病(Alzheimer’s disease,AD)防治中的应用提供实验依据。方法将原代培养的星形胶质细胞随机分为对照组、Aβ组及Aβ加3个浓度孕酮组,分别处理24 h后,与神经元共培养。MTT法检测神经元的存活率;ELISA检测条件培养液中炎症因子IL-1β和TNF-α的水平;免疫荧光法和Western blot检测星形胶质细胞NF-κB的活性。结果孕酮浓度依赖地抑制Aβ诱导的星形胶质细胞活化引起的神经元存活率下降;抑制Aβ诱导的星形胶质细胞IL-1β和TNF-α释放的升高;抑制Aβ诱导星形胶质细胞NF-κB的活性增加。结论孕酮通过抑制Aβ诱导的星形胶质细胞活化,发挥神经元保护作用,其作用机制可能与NF-κB信号通路有关。

临床药师参与3例儿童大剂量甲氨蝶呤治疗及文献分析

大剂量甲氨蝶呤是儿童血液肿瘤治疗中的重要手段,极大提高了疾病缓解率,然而其严重的毒副作用给患儿带来巨大伤害。本文通过临床药师参与3例患儿使用大剂量甲氨蝶呤的治疗过程,根据患儿不同的情况开展个体化的药学监护,对于甲氨蝶呤浓度较高或出现消除延迟的患儿,及时且合适的亚叶酸钙解救策略和对症处理可以降低甲氨蝶呤的毒性反应。在保证甲氨蝶呤药效的同时尽可能降低严重不良反应的发生。最后,结合治疗过程和文献分析,探讨临床药师基于血药浓度监测对儿童使用大剂量甲氨蝶呤的个体化治疗和药学监护的方法。

孕酮对Aβ_(25-35)诱导的大鼠皮质神经元tau蛋白过度磷酸化的抑制作用

目的探讨孕酮对凝聚态Aβ25-35诱导的原代大鼠皮质神经元tau蛋白过度磷酸化的影响及其可能的作用机制。方法将原代培养10 d的SD大鼠皮质神经元分为对照组、Aβ25-35损伤组和孕酮保护组。Aβ25-35损伤组给予Aβ25-3520μmol/L,孕酮保护组给予Aβ25-3520μmol/L和孕酮1μmol/L,作用24 h后,通过蛋白免疫印迹法检测大鼠皮质神经元内tau蛋白磷酸化水平和磷酸化AKt(p-AKt)蛋白表达水平。结果 Aβ25-35损伤组神经元内tau蛋白在Ser404、Thr231位点磷酸化水平较对照组升高,孕酮保护组tau蛋白磷酸化水平较Aβ25-35损伤组降低(P<0.05)。Aβ25-35损伤组神经元内p-AKt的蛋白表达较对照组降低,孕酮保护组p-AKt的蛋白表达高于Aβ25-35损伤组(P<0.05)。结论孕酮可能通过增加AKt的活性抑制Aβ25-35诱导的大鼠皮质神经元tau蛋白的过度磷酸化。

某儿童医院132例中药注射剂不良反应报告分析

目的为中药注射剂的临床合理应用提供参考。方法收集河北省儿童医院2012年12月至2017年12月上报的132例由中药注射剂引起的药品不良反应(ADR)报告,汇总并进行回顾性分析。结果132例ADR报告中,患儿男86例(65.15%),女46例(34.85%);1~3岁年龄段ADR构成比最高(53.79%);清热解毒类中药注射剂引起的ADR最多,与呼吸系统疾病发生率高有关,且多为联合用药;累及系统以皮肤及其附件最突出,共92例(69.70%);ADR多为一般不良反应,共101例(76.52%),且大多预后良好,痊愈111例(84.10%)。结论临床应高度重视儿童这一特殊群体中中药注射剂的应用,合理使用,并加强ADR的监测及上报工作,减少或避免不良反应的发生。

基于网络药理学和分子对接探讨桔梗-甘草防治COVID-19的机制

目的利用网络药理学和分子对接技术探讨桔梗-甘草药对干预新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的分子机制。方法基于数据库TCMSP检索桔梗-甘草药对的化学成分和作用靶点,通过Gene Cards、OMIM、TTD、PharmGkb和DrugBank等数据库筛选COVID-19的疾病靶点。应用Cytoscape 3.7.2软件构建药物-成分-靶点的PPI(protein-protein interaction)网络,并寻找核心基因。同时,运用数据库Bioconductor进行GO(gene ontology)分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析,预测其作用机制。运用AutoDock tools 1.5.6软件,将主要成分与新型冠状病毒关键结合位点蛋白[SARS-CoV-2主要蛋白酶(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 main protease,Mpro)和血管紧张素转化酶Ⅱ(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)]进行分子对接模拟验证。结果共挖掘到活性成分99种(桔梗7种和甘草92种)、2766个药物靶点、疾病靶点674个、交集基因靶点67个和核心基因10个,包括RELA、STAT1、MAPK3、TP53、MAPK1、MAPK8、STAT3、MAPK14、IL1B和TNF。GO富集分析显示桔梗-甘草药对干预COVID-19的主要功能是抗氧化反应、细胞对化学压力的反应、凋亡信号通路的调控、对脂多糖的反应和对细菌起源分子的反应等。KEGG通路涉及Coronavirus disease-COVID-19通路、IL-17信号通路等,也与免疫反应相关通路、炎症相关通路、抑制病毒感染通路和其他抑制癌症的通路相关。分子对接结果显示鳞叶甘草素A、槲皮素、甘草查尔酮A和木犀草素与Mpro和ACE2有较好的结合能力。结论桔梗-甘草药对可以通过多成分、多靶点和多通路联合方式干预新型冠状病毒,同时其核心成分与Mpro、ACE2有较好的结合能力,为COVID-19的防治提供了中医药可能性理论支持。

用HPLC-MS/MS法测定儿童微量血浆中地高辛浓度

目的建立液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法检测血浆中地高辛含量,并用于患儿治疗药物监测(TDM)。方法取血浆样本10μL经乙腈沉淀蛋白,用Phenomenex Kinetex EVO C18(30.0 mm×2.1 mm,2.6μm)色谱柱分离,流动相为水(含0.05%甲酸和2 mmol·L^(-1)乙酸铵)和甲醇,梯度洗脱,流速:0.55 mL·min^(-1),进样体积:30μL,柱温:45℃。电喷雾离子源正离子模式,动态多反应监测(dMRM)扫描分析,离子通道分别选择为m/z 798.3→651.3(地高辛)和m/z 801.3→654.3(地高辛-d3)。考察该方法的专属性、标准曲线与定量下限、准确度和精密度、提取回收率、基质效应以及稳定性。结果地高辛及内标的保留时间均为1.39 min,地高辛在0.25~8.00 ng·mL^(-1)线性良好,代表性的标准曲线方程为y=18.08×10^(-2)x+29.71×10^(-4)(r^(2)=0.99577),批内和批间精密度相对标准偏差均小于15%,提取回收率为91.00%~99.50%,稳定性良好,基质效应符合规定。本方法成功用于65例患儿的地高辛血药浓度测定。结论本方法操作简便、快速、准确、专属性强,可用于患儿临床治疗药物监测。

用高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定川崎病患儿血浆中阿司匹林和水杨酸的药物浓度

目的 建立高效液相色谱-同位素稀释质谱(HPLC-IDMS)法测定川崎病患儿血浆中阿司匹林(ASP)和水杨酸(SA)浓度的方法。方法 血浆样品经有机溶剂沉淀蛋白后,分别以ASP-D4和SA-D4为内标,采用Phenomenex Kinetex XB C18色谱柱(2.6 mm×50.0 mm, 3.0μm),以0.1%甲酸-水(A)和乙腈(B)作为流动相进行梯度洗脱,流速为0.5 mL·min^(-1),进样量为6μL。质谱检测方式为负离子模式,多反应监测扫描。结果 ASP在1.02~4 000 ng·mL^(-1)线性关系良好(r2=0.995 4),定量下限(LLOQ)为1.02 ng·mL^(-1)。SA在1.28~5 000 ng·mL^(-1)线性关系良好(r2=0.998 5),LLOQ为1.28 ng·mL^(-1)。准确度、精密度、基质效应和稳定性均符合《中国药典》(2020年版)规定。结论 该方法操作简便快速稳定,灵敏度专属性高,可用于ASP和SA在川崎病患儿中的治疗药物监测和群体药代动力学-药效学研究。

用同位素稀释-HPLC-MS/MS法同时检测儿童微量血浆中4种抗菌药物的浓度

目的建立同时测定微量血浆中美罗培南、利奈唑胺、伏立康唑和泊沙康唑4种抗菌药物浓度的高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)法,并用于儿童患者治疗药物监测(TDM)。方法血浆样本经甲醇沉淀蛋白前处理,分别以美罗培南-d6、利奈唑胺-d3、伏立康唑-d3和泊沙康唑-d4作为内标,用EVO-C18色谱柱分离,流动相为水(含0.1%甲酸)和乙腈(含0.1%甲酸),梯度洗脱;流速为0.5 mL·min^(-1)。质谱检测方式为电喷雾离子源正离子模式,多反应监测(MRM)扫描。结果美罗培南浓度在0.5~64.0μg·mL^(-1)线性关系良好(r=0.9992);利奈唑胺和伏立康唑浓度在0.2~25.6μg·mL^(-1)线性关系良好(r=0.9992,r=0.9999);泊沙康唑浓度在0.1~12.8μg·mL^(-1)线性关系良好(r=0.9989)。准确度、精密度、基质效应和稳定性均符合要求。本方法经过验证后成功应用于49例儿童患者的抗菌药治疗药物监测。结论本方法操作简便、快速、灵敏度高,适用于人血浆中美罗培南、利奈唑胺、伏立康唑、泊沙康唑4种抗菌药物浓度的分析,可用于儿童患者临床治疗药物监测。

用HPLC-MS/MS法测定重症感染患儿微量血浆/血清中利奈唑胺和万古霉素浓度

目的建立一种高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)法快速测定重症感染患儿微量血浆/血清中利奈唑胺和万古霉素浓度。方法血浆/血清10μL经甲醇沉淀蛋白后取上清液直接进样分析,内标分别为利奈唑胺-D3和去甲万古霉素;用Kinetex^(R)EVOC18柱(30.0mm×2.1mm,2.6μm)分离,以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈为流动相,梯度洗脱,流速:0.5mL·min^(-1),柱温:40℃,进样量:2μL,分析时长:2min。电喷雾离子源正离子扫描下,用多反应监测模式进行质谱分析。考察该方法的专属性、定量下限和标准曲线、准确度和精密度、回收率、基质效应、稳定性、血清和血浆样品的交叉验证、溶血效应和高脂效应。结果利奈唑胺、万古霉素及内标利奈唑胺-D3、去甲万古霉素的保留时间分别为1.18、1.03、1.17、1.01min。利奈唑胺在0.2~25.6μg·mL^(-1)内呈良好的线性关系,回归方程是y=8.95×10^(-1)x+3.49×10^(-3)(r=0.9971),定量下限为0.2μg·mL^(-1);万古霉素在1~128μg·mL-内呈良好的线性关系,回归方程是y=3.13×10^(-1)x+6.93×10^(-2)(r=0.9974),定量下限为1μg·mL^(-1);批内、批间精密度的相对标准偏差(RSD)均≤9.55%。2种药物的平均提取回收率均在96.24%~104.57%;内标归一化基质因子的RSD≤7.58%;血浆和血清基质样品可交叉检测,利奈唑胺和万古霉素最高可承受的溶血程度分别为2%和5%,高脂效应均不影响2种抗菌药测定结果。样品的稳定性在试验条件下均良好。该法成功用于我院28例重症感染患儿血浆样本分析。结论本方法所需样本量少,简单、快速、准确、稳定、应用范围广,可应用于利奈唑胺和万古霉素在儿童治疗药物监测及联合用药研究。

HPLC-MS/MS法快速检测儿童患者血浆中甲氨蝶呤和万古霉素的浓度

目的建立高效液相色谱串联质谱法同时测定临床血浆中甲氨蝶呤和万古霉素的浓度,并用于儿童患者治疗药物监测。方法血浆样本经乙腈沉淀蛋白前处理,用C18色谱柱分离,流动相为0.1%甲酸水和乙腈,梯度洗脱,流速为0.55 mL·min^(-1)。质谱检测方式为正离子模式,多反应监测扫描,监测甲氨蝶呤m/z 455.1→m/z 308.2,甲氨蝶呤-d3 m/z 458.1→m/z 311.1(内标);万古霉素m/z 725.4→m/z 144.2,去甲万古霉素m/z 718.5→m/z 144.2(内标)。结果甲氨蝶呤浓度在25~1500 ng·mL^(-1)与峰面积线性关系良好(r=0.9988),万古霉素浓度在1~50μg·mL^(-1)与峰面积线性关系良好(r=0.9988)。准确度、精密度、基质效应和稳定性均符合要求。结论本方法操作简便快速准确专属性强且稳定性良好,适用于人血浆中甲氨蝶呤和万古霉素的分析,可用于儿童患者临床治疗药物监测。

用HPLC-MS/MS法测定儿童微量血浆中多种治疗性药物的浓度

目的 建立血浆中多种治疗性药物浓度测定的高效液相色谱串联质谱法,并用于儿童患者治疗药物监测。方法 取血浆样本10μL,经甲醇沉淀蛋白,色谱柱:Phenomenex Kinetex EVO C_(18)(50.0 mm×2.1 mm, 2.6μm)色谱柱分离,流动相:水含1.0×10^(-5)mmol·L^(-1)甲酸-甲醇,梯度洗脱,流速:0.45 mL·min^(-1),柱温:45℃。电喷雾电离,正负离子切换,动态多反应监测扫描。结果 甲氨蝶呤线性范围为31.25~1 000.00 ng·mL^(-1)、丙戊酸线性范围为6.25~200.00μg·mL^(-1)、左乙拉西坦和10,11-二氢-10-羟基卡马西平线性范围均为1.56~50.00μg·mL^(-1)、拉莫三嗪和卡马西平线性范围均为0.78~25.00μg·mL^(-1),各待测物的线性关系良好(均R^(2)>0.99)。该方法的专属性、准确度、精密度、基质效应和稳定性均符合要求。本方法应用于治疗药物监测,已完成498例患儿样本检测。结论 本方法操作简便、快速,灵敏度良好,适用于儿童患者临床治疗药物监测。

HPLC-ESI-MS/MS同时测定癫痫患儿血浆中丙戊酸、苯巴比妥和托吡酯的药物浓度

目的建立基于高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-ESI-MS/MS)同时测定癫痫患儿血浆中丙戊酸、苯巴比妥和托吡酯浓度的方法,用于癫痫患儿的血药浓度监测及结果分析。方法样品用有机溶剂沉淀蛋白法进行前处理,分别以丙戊酸-D6、托吡酯-D12、苯巴比妥-D5为内标,采用Phenomenex Kinetex^(®)EVO C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,2.6μm),以0.07%甲酸-1 mmol乙酸铵-水(A)和甲醇(B)作为流动相进行梯度洗脱,流速为0.5 mL·min^(-1)。质谱检测系统采用电喷雾离子源负离子模式,多离子反应监测模式扫描。考察该方法的专属性、定量下限(LLOQ)、标准曲线、残留效应、稀释效应、准确度、精密度、基质效应和稳定性。结果丙戊酸在0.6~120μg·mL^(-1)线性关系良好(r=0.998 9),LLOQ为0.6μg·mL^(-1);苯巴比妥在0.25~50μg·mL^(-1)线性关系良好(r=0.999 1),LLOQ为0.25μg·mL^(-1);托吡酯在0.25~50μg·mL^(-1)线性关系良好(r=0.999 0),LLOQ为0.25μg·mL^(-1)。批内和批间精密度RSD≤8.0%,稳定性良好,不受普通基质和溶血基质(溶血程度≤5%)的影响,方法学验证均符合中国药典2020年版规定。结论本方法快速、简便、稳定、经济,具有较高的灵敏度和特异性,可应用于监测临床癫痫患儿丙戊酸、苯巴比妥和托吡酯的血药浓度。