铜绿丽金龟气味结合蛋白AcorOBP11的表达纯化及功能分析

【目的】通过研究铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)气味结合蛋白11(odorant binding protein 11,OBP11)与寄主植物挥发物的结合特性,探讨AcorOBP11的功能,为阐明铜绿丽金龟识别寄主植物的嗅觉分子机制打下基础。【方法】设计特异性引物,通过RT-PCR克隆AcorOBP11,分析其序列特征并与相似序列进行对比;将目的基因OBP11连入原核表达载体pET28a后,重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。利用IPTG诱导AcorOBP11重组蛋白的表达,超声破碎菌体,取上清液过镍柱,利用重组肠激酶切除His标签后再次过镍柱纯化获得目的蛋白;纯化后的蛋白以1-NPN为荧光探针开展荧光竞争结合试验,测定AcorOBP11蛋白与37种寄主植物挥发物的结合特性;利用Modeller对AcorOBP11进行同源建模,以冈比亚按蚊气味结合蛋白AgamOBP48(PDB ID:4ij7)作为模板,获得其三维结构;利用Autodock半柔性对接将蛋白与化合物对接,模拟AcorOBP11与6种候选寄主植物挥发物的结合情况。【结果】克隆获得了AcorOBP11全长基因,开放阅读框共639 bp,N末端有17个氨基酸组成的信号肽,具有8个保守的半胱氨酸位点,属于Plus-C OBP亚家族,进化树结果表明其与HparOBP9进化关系最近。AcorOBP11成功连入pET28a表达载体,在0.25 mmol·L^(-1) IPTG、37℃条件下诱导表达,并通过两次镍柱纯化得到目的蛋白。竞争结合试验结果表明,AcorOBP11结合谱较广,对α-紫罗兰酮、异戊醛、丙烯酸-2-乙基己酯、乙酸龙脑酯、柠檬烯、反-2-己烯醛、2-乙基己醛、异戊酸等13种寄主植物挥发物有较好的结合能力。其中,与寄主植物挥发物α-紫罗兰酮结合能力最好,竞争解离常数为22.78μmol·L^(-1)。构建了AcorOBP11三维结构图并进行蛋白构象评估后,与6种化合物进行分子对接,结果表明AcorOBP11与α-紫罗兰酮结合自由能最低,为-24.74 kJ·mol^(-1),表明其与α-紫罗兰酮的结合能力最强,与荧光竞争结合结果一致;从对接图还可以看出,α-紫罗兰酮不仅与AcorOBP11在Cys163处形成氢键,而且其疏水端进入了蛋白的疏水腔,两个甲基与蛋白表面高度契合,因此,α-紫罗兰酮与蛋白间结合能力最强。【结论】AcorOBP11能够识别多种寄主植物挥发物,推测其在铜绿丽金龟成虫定位寄主植物中发挥重要作用,此研究结果为生态防控铜绿丽金龟提供了新思路。

桂林红色文化融入当地中职政治课的沉浸式路径探究

红色文化具有天然思政教育价值,将地方红色文化融入当地中职政治课教学既有利于红色文化的传承,也有利于增进青年学生对家乡的归属感和文化认同感。桂林红色是红色文化的典型代表,它承载地方人文基因,具有良好的社会经济价值。将桂林红色文化融入当地中职政治课教学,可以通过沉浸式教学法,让学生在“在场”与“入境”体悟红色文化精神,增强政治课的育人效果。

二氧化碳在华北大黑鳃金龟幼虫定位寄主植物根系中的作用

为探究二氧化碳(CO_(2))在华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita幼虫定位寄主植物根系时所发挥的作用,对其开展了触角电位生理反应及行为生测试验。研究结果表明,CO_(2)浓度为0.75%、1.5%、3%、6%时均能显著激发幼虫的触角电位和趋性反应,且随着浓度增加幼虫对CO_(2)的趋向爬行所用时间显著缩短;根系分泌物同样能引起华北大黑鳃金龟幼虫的触角电位和趋性行为反应,且与1.5%CO_(2)间无显著差异;将1.5%CO_(2)分别与棕榈酸甘油酯、2-丁烯酸、肉豆蔻酸、十四烷、4-甲基-2-氧戊酸、十二烷、环己六醇、邻二甲苯和对羟基苯甲酸等9种根系分泌物混合后对试虫引诱效果增强,其趋向爬行时间显著缩短。以上结果显示,CO_(2)在华北大黑鳃金龟幼虫定位寄主植物根系过程中发挥了重要的指引和增效作用,试验结果可为华北大黑鳃金龟幼虫的绿色防治提供新思路。