雷公藤甲素对Heymann肾炎模型足细胞病变的影响

目的:利用被动型Heymann肾炎模型(passive Heymann nephritis,PHN)研究雷公藤甲素(triptolide)对膜性肾病的疗效及其对足细胞病变的影响。方法:实验动物分为正常对照组、PHN组和雷公藤甲素治疗组。雷公藤甲素(200μg/kg·d)灌胃治疗,分别在观察7天、14天、21天和28天时宰杀大鼠,留取血清和尿标本,观察尿蛋白、血清白蛋白、肝酶、肌酐和外周血白细胞等指标的变化;留取肾组织标本,行光镜、免疫病理、电镜和免疫电镜检查,并对肾组织IgG、C5b-9沉积以及Nephrin和Podocin的分布进行观察。结果:(1)尿蛋白:雷公藤甲素治疗7天即可显著降低PHN大鼠的蛋白尿,至14天、21天和28天时,治疗组大鼠的尿蛋白进一步降低,与Heymann肾炎大鼠之间差异有统计学意义(P<0·01)。在尿蛋白显著降低的同时,血浆白蛋白显著增加。(2)肾小球上皮侧免疫沉积物:电镜观察结果显示,雷公藤甲素治疗组上皮侧免疫复合物、钉突以及基膜反应性增殖均较Heymann肾炎组似有所改善,治疗后上皮侧电子致密物减少,基膜反应减轻,但在尿蛋白明显减少的同时,上皮侧电子致密物始终存在。(3)肾小球IgG和C5b-9的沉积:经雷公藤甲素治疗后肾小球IgG和C5b-9的沉积与Heymann肾炎大鼠相比,荧光强度有所减少,尤其在治疗后的第7天,减少较为明显。(4)足细胞病变:经雷公藤甲素治疗7天、14天、21天和28天后,均可见足细胞的足突损伤比对照组明显减轻,足突融合显著改善,足突宽度显著降低,观察至第28天时,治疗组可见大部分足细胞的足突形态基本恢复正常。(5)足细胞裂孔膜蛋白的变化:经雷公藤甲素治疗7天后,足细胞表面Nephrin和Podocin的表达比Heymann肾炎大鼠有明显增加,分布上的异常开始得到纠正,至第21天基本恢复成连续的线样分布。免疫电镜的结果再次显示了治疗后Nephrin的上述修复过程。结论:雷公藤甲素对被动型Heymann肾炎具有显著的治疗作用,能有效地减少蛋白尿,减轻肾组织免疫损伤,促进足细胞病变和裂孔膜蛋白结构的修复。雷公藤甲素疗效机制除了其免疫抑制和抗炎作用外,还与它能显著地改善和修复足细胞病变有关。

有机溶剂肾损害的动物实验研究

目的:利用大鼠吸入有机溶剂的模型考察有机溶剂对肾脏的损害及其特点。方法:采用SD大鼠,放入IVC密闭笼内,吸入混合有机溶剂(汽油、二甲苯和甲醛按2∶2∶1的比例混合)12周,总浓度为12000PPM,每日吸入两次。结果:(1)在吸入有机溶剂5～6周后部分大鼠开始出现蛋白尿,此后缓慢增加,观察至12周时雄性组和雌性组的蛋白尿阳性率分别为43.8%(7/16)和25%(4/16),尿蛋白含量分别为(23.8±2.4)mg/gSCr和(21.2±3.1)mg/gSCr。(2)实验大鼠尿NAG酶在吸入有机溶剂4周时即明显升高,第6周时雄性组和雌性组的尿NAG分别为(36.3±4.5)U/gSCr和(25.2±3.8)U/gSCr,肾组织TUNEL染色可观察到肾小管上皮细胞的凋亡。(3)光镜下观察可见皮质区近端小管上皮细胞刷状缘脱落、扁平,部分小管上皮细胞崩解、脱落至管腔中。部分肾小球可见肾小管返流和轻度的壁层上皮细胞增生。超微结构观察可见多处近端小管上皮细胞刷状缘及胞质脱落,上皮细胞崩解。线粒体变性消失,内膜与外膜剥离。足细胞节段足突融合,个别见足突剥离,胞质可见细小微绒毛化。系膜区、内皮下、上皮侧及基膜均未见电子致密物沉积。(4)免疫荧光染色显示,有机溶剂吸入12周后少数肾小球的Nephrin和Podocin呈节段不连续的颗粒样分布。部分足细胞中Desmin的表达显著增加,表明有机溶剂对足细胞的骨架结构存在损伤作用。结论:大鼠吸入有机溶剂后可出现蛋白尿、显著的肾小管上皮细胞损伤和肾小球足细胞的节段损伤,初步证实有机溶剂导致大鼠的肾损害。有机溶剂对肾小管上皮细胞的损伤明显早于足细胞,对肾小管上皮细胞损伤的程序明显比足细胞严重。

雷公藤甲素对足细胞损伤的保护作用研究

目的观察雷公藤甲素对足细胞损伤的保护作用,并对其作用机制进行了研究.方法建立大鼠被动型Heymann肾炎模型（passive Heymann nephritis,PHN）、氨基核苷嘌呤霉素（puromycin aminonucleoside,PAN）致足细胞损伤的大鼠模型;以纯化的C5b6及C7～C9体外组装C5b-9,建立足细胞亚溶破模型;建立PAN致足细胞损伤的细胞模型、AngⅡ诱导的足细胞损伤模型,利用免疫荧光法和流式细胞仪分析等方法分析足细胞裂孔膜相关分子Nephrin和Podocin在足细胞的分布及表达量的变化;分析足细胞骨架相关蛋白F-actin和Synaptopodin的变化,并进一步观察了细胞内调节骨架装配的Rho/ROCK信号通路的活性,Westernblot检测p-38,细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和C-Jun氨基端激酶（JNK）丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化水平.研究雷公藤甲素对足细胞损伤的保护作用及其机制.结果（1）在PHN模型中,雷公藤甲素能明显地减少Heymann肾炎大鼠的蛋白尿,足细胞足突损伤明显减轻,足突融合明显改善,足细胞裂孔膜关键分子如nephrin和podocin的表达水平明显增加,分布形态也从颗粒状不连续分布变为正常连续性分布,提示雷公藤甲素能直接改善和修复足细胞病变.（2）在PAN介导的非免疫性足细胞病变大鼠模型中,进一步证实了雷公藤甲素对蛋白尿的治疗作用和对足细胞损伤的影响.（3）在PAN和AngⅡ诱导足细胞损伤模型中,雷公藤甲素抑制PAN和AngⅡ诱导的足细胞ROS产生,抑制PAN和AngII诱导的细胞内p38MAPK信号通路的活化.（4）在C5b-9导致的足细胞损伤模型中,雷公藤甲素不依赖于对ROS影响而独立地作用于p38MAPK信号通路.（5）雷公藤甲素能呈剂量依赖性的拮抗AngⅡ诱导的骨架蛋白解聚和细胞间连接分子的重排.结论雷公藤甲素具有直接的足细胞保护作用,是治疗肾小球疾病的一种非常有潜力的药物.

人穿孔素氨基端肽段的原核表达与纯化

目的 :用基因工程方法表达人穿孔素 (PFP)氨基端肽段 ,并加以纯化。 方法 :构建表达人 PFP蛋白 N端118个氨基酸肽段 (h PFP- N)的重组质粒 ,转化 E. coli BL 2 1菌株 ,经异丙基 -β- D-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。在十二烷基肌氨酸钠存在下以超声处理 ,使得到的融合蛋白包涵体溶解。通过谷胱甘肽琼脂糖柱亲和层析获得纯化的 GST/h PFP- N融合蛋白 ,经凝血酶酶切去除 GST部分。 结果与结论 :p GEX- KG质粒能够高效表达 GST/h PFP- N融合蛋白 ,经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析和凝血酶酶切后得到纯化的 h PFP- N蛋白。

定量RT-PCR检测穿孔素mRNA方法的建立与临床初步应用

目的 建立检测穿孔素mRNA的定量RT PCR方法。方法 用限制性内切酶制备竞争性模板 ,建立定量RT PCR方法 ,检测正常人及部分肿瘤病人外周血的穿孔素mRNA水平。结果 6例正常人的外周血穿孔素mRNA含量为 0 5 1± 0 40pmol/ml,消化道肿瘤患者的穿孔素mRNA水平与正常相比 ,有显著差异 (P <0 .0 1) ,乳腺肿瘤及白血病患者的穿孔素mRNA水平与正常人相比 ,没有差异。结论 穿孔素mRNA水平的降低可能是肿瘤发生的一个重要原因 ;除穿孔素途径以外 ,还存在别的抗肿瘤的效应机制。

肿瘤坏死因子α拮抗剂的研究进展

肿瘤坏死因子 α(TNF α)的过量表达与很多疾病密切相关 ,应用TNF α的拮抗剂降低这些疾病中的TNF α水平 ,将成为一种有效的治疗措施。已开发的TNF α拮抗剂主要包括TNFR与IgG的Fc段形成的融合蛋白和抗TNF α的单抗两大类 ,利用抗体嵌合技术、CDR区移植和噬菌体展示技术对抗TNF α的单抗进行了人源化 ,并开展了对类风湿性关节炎和结肠Crohn病等免疫性疾病的临床试验研究。本文就这些TNF α拮抗剂的研究进展作一综述。

三种方法检测尿源大肠埃希菌P菌毛的比较研究

三种方法检测尿源大肠埃希菌Ｐ菌毛的比较研究秦卫松①邵海枫李珍大宗永兰（南京军区南京总医院全军医学检验中心，南京２１０００２）冯文兵（滁州市中医院，２３９００１）关键词大肠埃希菌血凝法玻片法酶联免疫吸附试验尿路感染中大肠埃希菌借助菌毛粘附于尿道上皮细胞...

我院1995年度临床分离细菌的药敏分析

中图法分类号Ｒ３７２细菌感染患者的正确治疗要求及时诊断、排除非感染性的各种内外因素以及合理应用抗生素。抗生素的大量应用，使耐药菌株呈不断上升趋势。各地区、各医院临床使用抗生素习惯上的不同，造成了分离菌株对药物敏感性水平也不尽相同。本文提供了我院１９９...

艾滋病的病原学检测

艾滋病的病原学检测秦卫松关键词艾滋病，病毒核酸，病毒抗原，抗体中图法分类号Ｒ５１２．９１人类免疫缺陷病毒（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）感染的病原学检测，包括分离病毒、检测病毒核酸、检测病毒抗原及抗体，能为ＨＩＶ感染的...

雷公藤甲素干预足细胞病变的体外观察

目的:雷公藤甲素对Heymann肾炎和嘌呤霉素肾病大鼠的疗效及其对足细胞病变的影响提示,雷公藤甲素有可能直接作用于足细胞,从而改善其病变状况。本研究借助小鼠足细胞系,体外观察了雷公藤甲素对足细胞损伤的保护和修复作用,并对其作用机制进行了研究。方法:体外采用氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleo-side,PAN)致足细胞损伤模型。观察雷公藤甲素对足细胞损伤的保护作用研究中,雷公藤甲素与足细胞预孵育30min后,再加入含PAN的培养基,继续作用24h;观察雷公藤甲素对足细胞损伤的修复作用研究中,PAN作用足细胞24h,造成足细胞明显损伤后,再加入含或不含雷公藤甲素的培养基,继续培养3天。免疫荧光法和流式细胞仪分析足细胞骨架相关蛋白F-actin和Synaptopodin的变化,并进一步观察了细胞内调节骨架装配的Rho/ROCK信号通路的活性,即采用Western Blot检测ROCK-I底物——肌球蛋白磷酸酶结合亚单位(MBS)磷酸化水平,以及Rho/ROCK信号通路选择性阻断剂Y-27632对雷公藤甲素作用的影响。同时采用免疫荧光法和流式细胞仪分析足细胞裂孔膜相关分子Nephrin和Podocin在足细胞的分布及表达量的变化。结果:正常分化足细胞F-actin呈丝状结构,密度大,丝强劲有力,沿细胞极性分布;Synaptopodin呈颗粒状沿细胞骨架分布。裂孔膜蛋白Nephrin沿足细胞膜和细胞骨架分布,Podocin呈线状均匀分布于胞浆内,PAN作用24h后,细胞足突回缩,F-actin几乎完全解聚,Synaptopodin表达消失。Nephrin和Podocin表达减弱,正常丝状结构消失。而经过雷公藤甲素的预处理,PAN诱导的足细胞损伤明显减弱,足细胞未表现出上述骨架结构的改变,Synaptopodin表达没有明显减弱。同时我们的结果显示,在PAN造成足细胞明显损伤后再加入雷公藤甲素,足细胞损伤能够得到一定修复,细胞内重新出现极性分布的微丝,同时,Synaptopod-in的表达也得以修复。Rho/ROCK信号通路研究显示,100μg/mlPAN明显降低Rho/ROCK通路活性。雷公藤甲素能有效遏制MBS磷酸化水平的降低,维持足细胞Rho/ROCK通路的活性状态。Rho/ROCK信号通路选择性抑制剂Y-27632可阻断雷公藤对足细胞骨架结构的保护作用。此外,对裂孔膜蛋白Nephrin,Podocin的研究表明,不论是在预防组和治疗组,PAN对Nephrin和Podocin的损伤可在一定程度上被雷公藤甲素预防和修复。结论:雷公藤甲素可稳定足细胞的细胞骨架,拮抗PAN对足细胞的损伤。在足细胞损伤已经发生后,雷公藤甲素可逆转足细胞的损伤,修复足细胞骨架结构和相关分子的表达。雷公藤甲素的上述作用与细胞内Rho/ROCK信号通路密切相关。雷公藤甲素对足细胞的影响可能是其降低肾小球肾炎患者尿蛋白的重要机制之一。

糖尿病肾病患者血清及尿液代谢组学特点及临床意义

目的:应用代谢组学方法观察不同时期糖尿病肾病(DN)患者的血清及尿液糖、脂和氨基酸代谢产物变化规律,并用于发现DN早期诊断及病情进展的生物标志物。方法:选取90例确诊2型糖尿病的成年男性患者,分尿白蛋白正常组、微量白蛋白尿组及蛋白尿组。选取性别年龄匹配的正常对照25例,收集血清及尿液标本,分别经气相色谱/质谱(GC/MS)及液相色谱/质谱(LC/MS)检测。结果:不同组别DN患者血清及尿液代谢产物水平呈现完全不同的分布。多种糖代谢通路存在紊乱,糖酵解和三羧酸循环通路障碍表现为血清葡萄糖水平升高而糖酵解和三羧酸循环产物未见显著改变;蛋白激酶C通路异常活化表现为血清磷脂酰胆碱(PC)水平下降而花生四烯酸水平升高;己糖胺通路的异常活化表现为血清谷氨酰胺及尿液尿嘧啶二磷酸水平下降。血清支链氨基酸水平在尿白蛋白正常期出现升高,而蛋白尿期呈下降趋势;尿液氨基酸水平在尿白蛋白正常和蛋白尿组均低于正常对照组,而微量白蛋白尿组与正常对照组未见显著差异。血清必需脂肪酸在各组间未见显著差异,非必需脂肪酸和反式脂肪酸水平升高;脂肪酸β氧化障碍则表现为血清左旋肉碱及脂酰辅酶A水平下降。早期诊断的候选标志物有血清棕榈酸、尿PC(P-19∶1(12Z)/0∶1)和十八烷二酸;而疾病进展的候选标志物有血清左旋肉碱、PC(9∶0/0∶0)和Dg(17∶2(9Z,12Z)/20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0),尿液尿嘧啶二磷酸和lysoPC(16∶0)。结论:代谢组学方法可展示不同时期DN患者血清及尿液中代谢产物的变化特点,为进一步发现DN早期诊断及病情进展的生物标志物奠定基础。

马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞损伤中Ngal和Kim-1的变化及其意义

目的:研究马兜铃酸(AA)损伤的肾小管上皮细胞中急性肾损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Ngal)、肾损伤因子(Kim-1)的表达、分泌特点,并对其在AA肾毒性损伤中的意义进行探讨。方法:采用20μg/mlAA作用于体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK2细胞),通过RT-PCR和免疫荧光法分别检测Ngal、Kim-1基因和蛋白的表达,ELISA法检测培养上清中Ngal、Kim-1的分泌,底物显色法监测培养上清中N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(NAG)的释放,流式细胞术观察细胞周期改变和凋亡情况。结果:AA处理HK2细胞6～12h内,Ngal基因呈一过性表达增加,而Kim-1基因在处理24～48h内持续高水平表达。培养上清中Ngal、Kim-1和NAG的分泌呈不同变化规律:给药12h出现Ngal的一过性分泌高峰;Kim-1的分泌高峰出现在24h并持续48h;NAG的分泌在12h后开始增加,并持续增加至48h。诱导Ngal、Kim-1表达和诱导细胞凋亡的AA有效剂量不同。诱导Ngal和Kim-1显著分泌的AA剂量仅引起少量细胞凋亡;而引起大量细胞凋亡的AA剂量不能诱导Ngal和Kim-1分泌。结论:AA诱导的肾小管上皮细胞损伤伴有Ngal和Kim-1的异常表达和分泌。Ngal是AA损伤早期一过性表达和分泌的分子,而Kim-1和NAG则在损伤过程中呈持续分泌,因此对于临床监测AA所致肾小管损伤具有重要意义。Ngal和Kim-1在AA所致肾小管上皮细胞损伤中的异常表达,为进一步阐明AA肾毒性机制以及临床上早期发现马兜铃酸肾病提供了新的指标。

雷公藤甲素对血管紧张素Ⅱ诱导足细胞损伤的保护作用及其机制研究

目的:观察雷公藤甲素对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导足细胞损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法:免疫荧光染色分析足细胞骨架肌动蛋白(F-actin)和细胞间连接蛋白1(ZO-1)表达和分布;流式细胞仪分析荧光探针CM-H2DCFDA标记的细胞内活性氧(ROS);Western blot检测p-38,细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和C-Jun氨基端激酶(JNK)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化水平。结果:AngⅡ呈剂量依赖性破坏足细胞骨架结构和细胞间连接,表现为F-actin在胞质中的应力纤维解聚,F-actin的边聚。细胞间连接的断裂,细胞皱缩。雷公藤甲素呈剂量依赖性的拮抗AngⅡ诱导的骨架蛋白解聚和细胞间连接分子的重排,10ng/ml雷公藤甲素的作用最为明显。雷公藤甲素对足细胞AngⅡ的1型受体(AT1R)和2型受体(AT2R)的表达无明显影响。细胞内ROS及其下游的MAPK信号通路研究显示,AngⅡ(10-7mol/L)诱导足细胞内ROS的明显增加,激活p-38,ERK和JNK三条MAPK信号通路,雷公藤甲素(10ng/ml)或抗氧化剂N乙酰半胱氨酸(NAC)(10mmol/L)预处理细胞后,能够有效遏制AngⅡ诱导的细胞内ROS的产生,抑制MAPK信号通路的活化。结论:雷公藤甲素可稳定足细胞的骨架结构和细胞间连接,拮抗AngⅡ对足细胞的损伤。雷公藤甲素的上述作用与细胞内ROS及下游的p-38、ERKMAPK信号通路密切相关。雷公藤甲素干预AngⅡ诱导的足细胞损伤可能部分参与了其对肾小球疾病的疗效。