重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为102个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为101个/μL标准质粒,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。

饵料维生素C对青石斑鱼的非特异性免疫调节作用

调查了饵料维生素C对青石斑鱼Epinephelusawoara非特异性的体液和细胞免疫调节作用。在冰冻饵料小杂鱼中添加不同剂量的维生素C(每公斤饵料鱼含量分别为 0 ,50 0 ,1 0 0 0 ,1 50 0和 2 0 0 0mg) ,连续投喂青石斑鱼 2 0周后 ,青石斑鱼血液白细胞总数及不同种类白细胞 (包括淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞 )组成比例不受饵料维生素C的影响。青石斑鱼血清补体经典型溶解羊红细胞的能力随饵料维生素C添加量的提高而显著增强 (p<0 .0 1 )。然而 ,维生素C对血清的杀菌活性没有作用。鱼体非特异性的细胞免疫活动 (包括血液白细胞和头肾细胞的吞噬活动 )

创伤弧菌疫苗对青石斑鱼的免疫学效应和安全性

弧菌病是海水网箱养殖石斑鱼Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ主要疾病之一。本文利用致病菌──创伤弧菌Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ强毒菌株制备出安全性很高的福尔马林灭活疫苗（ＦＶ）和热灭活疫苗（ＨＶ）。这两种疫苗无论使用佐剂与否，通过肌肉注射接种青石斑鱼Ｅ．ａｗｏａｒａ都能使鱼体在较短时间内产生较强的体液免疫应答，而且抗体效价能维持较长时期。免疫后的青石斑鱼获得了良好的免疫保护力。

青石斑鱼对创伤弧菌粗制脂多糖的免疫学反应

从石斑鱼弧菌病病原创伤弧菌中提取出粗制脂多糖（LPS）加热去毒后注射免疫石斑鱼，鱼体在较短时间（7d）内快速产生体液免疫应答，应答期在56d以上．攻毒感染后，免疫鱼显示出较强的保护功能．

RNA干扰技术抑制新加坡石斑鱼虹彩病毒感染细胞多肽ICP46与绿色荧光蛋白融合基因的表达

新加坡石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46(infected cell polypeptides 46)基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞(fathead minnow cells,FHM)中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIVICP46的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIVICP46的siRNA(siRNA-ICP46),与pEGFP-ICP46共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点荧光强度的变化。转染后24～48h,实验细胞(共转染siRNA-ICP46和pEGFP-ICP46)和阳性对照细胞(共转染siRNA-GFP和pEGFP-ICP46)中的荧光微弱,发荧光的细胞数量较阴性对照(共转染siRNA-Negative和pEGFP-ICP46)少70%左右,但其后实验细胞和阳性对照细胞的荧光强度开始增强,在转染后72h其与阴性对照组已差别不大。说明体外化学合成的siRNA-ICP46转染后24～48h可有效抑制FHM细胞中外源导入SGIV ICP46基因的表达。

石斑鱼鱼虱病的病理学研究

本文报道南海鱼虱[CaligusnanhaiensisWu＆Pan]，引起的石斑鱼鱼虱病病理变化的研究结果。南海鱼虱对青石斑鱼[Epinephelusawoara（TemmincketSchlegel）]的危害主要是由于桡足幼体或对寄主组织的大量摄食，导致鳃部组织的完整性受到破坏，使寄主的生理功能受损害而引起病变。患病鱼的红细胞数、血清钠、钾、钙、血糖、尿素氛、胆固醇、白蛋白和总蛋白的含量与健康鱼比较，仅见红细胞数减少和血清钙的增加变化明显。

磷酸根对海洋克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇代谢的影响

海洋克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae HSL4是一株分离于海洋沉积物环境的用于发酵生产1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PDO)的优良菌株。K.pneumoniae HSL4发酵生产1,3-PDO的培养基包含多种营养因子,其中磷酸根对发酵过程影响较大。利用5L发酵罐进行补料发酵实验,分别考察培养基中低磷(1.6×10–4mol·L–1 PO43–)和高磷(5.0×10–3mol·L–1 PO43–)浓度条件下K.pneumoniae HSL4发酵生产1,3-PDO过程中细胞生长、1,3-PDO及多种副产物生成的规律,分析初始磷酸根浓度差异对K.pneumoniae HSL4不同发酵阶段代谢流分布的影响。结果表明,培养基中高、低初始磷酸根浓度条件下,1,3-PDO的终浓度均在75g·L–1左右。在低磷条件下,底物甘油消耗量较少,具有较高的1,3-PDO转化率;除2,3-丁二醇外,其他副产物在发酵液中的积累均小于高磷条件下副产物的积累。高磷条件促进乙酸、乙醇、乳酸等副产物生成,改变中、后期发酵环境,增加下游分离提取1,3-PDO的压力。根据高、低初始磷酸根浓度条件下菌体生物量、产物、副产物合成的差异,对细菌4个发酵时期(延滞期、对数生长期、平台期和衰亡期)的代谢流分布及其变化进行了分析。研究结果可以为合理配比培养基中磷酸盐浓度、进行发酵生产1,3-PDO过程控制与代谢调控提供理论依据。

新加坡石斑鱼虹彩病毒ICP46核输出信号序列的定位与功能鉴定

新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是一种重要的鱼类传染性病毒,可导致石斑鱼死亡率达90%以上,给石斑鱼的养殖造成巨大的经济损失。SGIV ICP46(infected cell polypeptides 46)是一个立即早期基因,可能参与细胞的生长调控,并对病毒复制有重要作用。在SGIV ICP46序列中存在一段富含亮氨酸(Leucine,L)的潜在核输出信号(nuclear export signal,NES)。为了深入研究该段NES序列在SGIV ICP46核转运过程中的作用,实验构建了3个NES缺失的突变体:仅含NES之前片段的突变体(ΔNESa)、仅含NES之后片段的突变体(ΔNESb)和不含NES的全长片段(ΔNESc),并在真核细胞中表达,观察这些突变体在细胞内的定位情况。转染细胞实验结果表明,野生型EGFP-ICP46重组蛋白可以有效地被输出细胞核,荧光信号主要分布在胞质区;相反,NES缺失的EGFP-ICP46-ΔNES重组蛋白不能被有效地输出细胞核,呈现与EGFP对照相同的泛细胞分布特征。突变实验证明,NES对SGIV ICP46输出细胞核具有决定性作用。

RNA干扰技术抑制SGIV ICP18绿色荧光融合蛋白表达的研究

将含有新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）ICP18基因的真核表达载体pEGFP-ICP18转染到胖头鲤细胞（Fathead minnow cells,FHM）中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP18-GFP融合蛋白呈点状分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIV ICP18的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIVICP18的siRNA（siRNA-ICP18）,与pEGFP-ICP18共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点的荧光强度变化。与序列非特异性siRNA（siRNA-negative）阴性对照相比,转染后24~48 h,共转染siRNA-ICP18和pEGFP-ICP18的实验细胞中发荧光的细胞数量较阴性对照少60%~80%左右,说明体外化学合成的siRNA-ICP18可有效抑制FHM细胞中外源导入SGIV ICP18基因的表达。

青海湖裸鲤形态性状对体质量的影响

青海湖裸鲤是我国的濒危物种之一,形态学数据是其亲本选育的基础。测定人工养殖的200尾2+龄青海湖裸鲤的全长、体长、头高、眼间距、体高、体宽、尾柄长、肛前距和臀鳍基长等9项形态学指标和体质量,采用通径分析、多元回归分析方法,研究青海湖裸鲤各形态形状与体质量的相关性。结果表明,青海湖裸鲤形态性状与体质量间的相关系数均有统计学意义(P<0.01);通过建立多元回归模型,发现青海湖裸鲤体长、体高、臀鳍基长对体质量影响有统计学意义(P<0.05);通径分析显示,体长对体质量的直接影响最大,其次为体高、臀鳍基长。

石斑鱼虹彩病毒ORF050的分子特征和功能初步分析

新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖产业严重经济损失的主要病毒病原之一。SGIV是大分子DNA病毒,包含162个基因开放阅读框,其中ORF050是一个肿瘤坏死因子受体类似物,可能在SGIV的免疫逃避中发挥作用。本研究克隆了SGIV ORF050基因,并构建了全长基因的真核表达重组质粒和四个半胱氨酸富集结构域(CRD)分别缺失的突变体。RT-PCR和药物抑制实验结果表明,SGIV ORF050是病毒的一个立即早期基因。亚细胞定位结果表明,该基因在细胞质内均匀地弥散性分布,并在细胞核周围聚集;第一个CRD缺失后,基因的定位发生明显的变化,即呈点状分布在胞质中,推测第一个CRD对其功能有影响。在过表达SGIV ORF050的鱼类细胞中观察SGIV感染引起的CPE,发现与对照相比没有明显区别;荧光定量PCR检测SGIV主要衣壳蛋白MCP的转录表达水平,也没有明显变化,提示该基因对SGIV在宿主细胞内的复制增殖可能没有影响。荧光定量PCR检测过表达ORF050的细胞在SGIV感染后宿主TNF/TNFR的转录水平,结果显示在感染10 h后TNF1、TNF2和TNFR2的表达量升高了2～3倍,而TNFR1的表达量没有明显变化,说明SGIV可能通过ORF050来调节细胞TNF和TNFR的表达,从而逃避宿主的免疫攻击。

30株大肠杆菌的泛基因组学特征分析

泛基因组(Pan-genome)是某一物种全部基因的总称,其中包括核心基因组(该物种所有个体中都存在的基因)和非必须基因组(只在部分个体中存在的基因,以及某个体特有的基因)。文章从泛基因组学角度比较分析了30株已经完成测序的大肠杆菌的基因、基因组成及其进化特征,结果表明核心基因只占据每株大肠杆菌全部基因数目的 50%左右,而平均每个菌株有146个特有基因,结果表明随着更多大肠杆菌菌株的基因组被测序,将会不断有新基因被发现。通过比较分析大肠杆菌不同菌株之间基因的保守性与基因的GC含量以及选择压力之间的关系,发现越保守的基因其GC含量变化范围越窄,同时在进化中受到的选择压力也越大。这些结果将有助于深入了解大肠杆菌基因组的进化特征及其基因组成的动态变化,并为预防和控制由致病性大肠杆菌引发的流行疾病提供理论依据,同时也为大规模病原菌基因组数据的分析方法提供借鉴。

细胞骨架蛋白actin参与石斑鱼虹彩病毒SGIV释放

在病毒感染宿主细胞过程中,病毒利用宿主细胞骨架如微丝、微管等完成进入、运输和释放等过程。为分离鉴定石斑鱼虹彩病毒SGIV囊膜蛋白,实验应用去污剂溶解病毒囊膜,然后结合1-D-SDS-PAGE切胶分离和LC-MS/MS质谱鉴定两种方法进行检测,除了病毒编码的囊膜蛋白外,还发现7种宿主细胞来源的蛋白,包括细胞骨架微丝肌动蛋白actin等,由此推测这些宿主蛋白是与病毒纯化过程中共纯化获得。鉴于actin在病毒感染中发挥着重要的作用,进一步通过蛋白印迹、免疫电镜实验验证了actin与病毒共纯化,揭示actin是一种来源于宿主细胞并包装到病毒颗粒表面的宿主蛋白,且由于特异性作用黏附于病毒粒子表面,在分离病毒囊膜时与囊膜蛋白共纯化。此外,荧光显微镜观察发现,在病毒感染晚期,细胞变圆,细胞微丝actin蛋白和SGIV病毒共定位于细胞膜,提示actin与病毒释放相关。同时电镜观察也表明,病毒在感染细胞中释放时获得由宿主细胞质膜衍生而来的囊膜,由此推测actin可能在病毒释放时特异性包裹于SGIV病毒表面。研究表明,actin参与石斑鱼虹彩病毒SGIV的释放过程。

高校水产微生物学课程教学的改革初探

水产微生物学是高校水产养殖专业的一门重要的专业基础课,该文结合水产养殖专业的特色与需求,对高校水产微生物学的教学内容、方法等进行初步改革探索,优化教学内容、教学方法,注重培养学生分析问题、解决问题的综合能力。

斜带石斑鱼PKR基因的克隆表达及亚细胞定位分析

根据实验室前期获得的斜带石斑鱼PKR基因的全长c DNA,对其原核表达、组织分布及亚细胞定位进行了研究分析。结果表明,斜带石斑鱼PKR基因c DNA全长为2 151 bp,其中ORF区为1 863 bp,编码621个氨基酸,表达蛋白的分子质量大小为70 157.15 Da,PI为5.72。通过NCBI网站上BLAST软件比对发现,斜带石斑鱼PKR与其他物种的PKR高度同源。通过构建原核表达载体PKR-p ET-32a,获得了斜带石斑鱼PKR的融合蛋白,经纯化后制备了斜带石斑鱼PKR鼠抗血清。利用荧光定量PCR对斜带石斑鱼PKR基因组织分布研究表明,该基因在所有检测组织中均有表达,其中肠的表达量最高,头肾次之。以荧光显微镜对其亚细胞定位进行了分析,该基因为全细胞分布,但主要分布于细胞质中。

石斑鱼PPAR-δ基因SNP位点和单倍型与抗虹彩病毒和神经坏死病毒抗性的关联

[目的]获得石斑鱼Epinephelus spp.抗病分子标记,选育石斑鱼抗病品系以解决石斑鱼病害频发的问题。[方法]基于免疫基因PPAR-δ的基因组DNA序列开展单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点筛选,并对这些位点分别进行石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)和神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)抗性的关联分析。[结果]在SGIV感染的易感组和抗感组样品中共筛查到9个SNP位点,均位于内含子中;多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)的范围为0.177~0.375,其中,SNP-S1(g.940T>A)属于低度多态(PIC<0.25),其余SNP位点属于中度多态(0.25≤PIC<0.50);关联分析结果显示,SNP-S7(g.4595T>A)基因型频率在SGIV易感组和抗感组中存在显著差异分布(P<0.05),SNP-S7的TT和AA这2种纯合子基因型与SGIV抗感性状相关,而AT杂合子基因型与SGIV易感性相关。在RGNNV感染的易感组和抗感组样品中共筛查到8个SNP位点,其中,SNP-N1位于外显子中,属于同义突变,其余SNP均位于内含子中;PIC的范围为0.106~0.317,其中,SNP-N1(g.324G>A)和SNPN2(g.883A>G)属于低度多态(PIC<0.25),其余SNP属于中度多态(0.25≤PIC<0.50);关联分析表明,SNPN5(g.2510C>T)基因型频率在RGNNV易感组和抗感组中存在显著差异分布(P<0.05),SNP-N5的CT基因型与RGNNV抗感性状相关, CC基因型与RGNNV易感性状相关。[结论]本研究在PPAR-δ的基因组DNA序列中分别筛选到与SGIV和RGNNV抗性相关的SNP标记各1个,可以为石斑鱼抗病育种提供技术支持和理论依据。

抗石斑鱼虹彩病毒药物的体外筛选

【目的】体外筛选抗石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的药物,为石斑鱼虹彩病毒病防控提供理论依据。【方法】应用石斑鱼脾脏组织细胞系(Grouper spleen,GS)-SGIV感染模型,从4种药物[盐酸金刚烷胺(AMA)、更昔洛韦(GCV)、绿原酸(CGA)和黄芩苷(BI)]中筛选有效的体外抗SGIV药物。通过显微镜观察和细胞活力检测不同药物对GS细胞的毒性,确定不同药物对GS细胞的安全工作浓度后,通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹分析等探究药物对SGIV感染复制的调节作用。【结果】细胞活力检测结果显示,4种药物AMA、GCV、CGA和BI处理GS细胞的最高安全工作浓度分别为200、200、1600和40μg/mL。显微镜下观察发现,AMA和GCV处理GS细胞后对SGIV感染的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)进程有明显的抑制作用,而CGA和BI没有明显抑制效果。实时荧光定量PCR检测结果显示,AMA和GCV处理可显著降低SGIV主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)和病毒囊膜蛋白(Viral protein VP088)的基因转录(P<0.05,下同)。蛋白印迹分析表明AMA和GCV对SGIV的MCP蛋白合成具有明显抑制效果。倒置荧光显微镜观察发现AMA和GCV处理明显减少感染过程中病毒加工厂的形成,提示AMA和GCV可能影响病毒装配。病毒滴度测定结果显示,AMA和GCV处理可显著降低SGIV感染过程中子代病毒的产量。【结论】应用SGIV体外感染模型筛选到的2种药物AMA和GCV具有一定的抗SGIV活性,且这种抗病毒能力主要通过抑制病毒的基因转录和蛋白合成,从而影响病毒的装配和产量。

渔业发展专业硕士水产动物疾病诊断与防控案例教学的探讨

课程案例库的建设在渔业发展专业学位研究生培养方案修订中扮演着重要角色,因为它将理论与实践相结合,激发了学生的兴趣,加深了对知识点的掌握。本文总结了水产动物疾病诊断与防控课程建设的必要性、内容设计、案例来源以及案例的实施方式,旨在为完善渔业发展专业学位系列课程案例库的建设提供参考。

在环道流水中药杀剑水蚤的试验报告

本文报导了在人工繁殖鱼苗生产中药杀环道用水中的剑水蚤的成功试验。施药后三分钟可将剑水蚤杀死99%,鱼苗则安然无佯。

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。