软骨肉瘤相关基因Sox9(siRNA)表达质粒的构建鉴定以及对肿瘤细胞生长和凋亡的影响

目的:利用小干扰阻断目的基因的原理将构建的目的基因Sox9的pSilencer3,1-H1 neo siRNA(small interfering RNA)表达质粒转染人体软骨肉瘤细胞HTB-94,观察目的基因被阻断后肿瘤细胞目的基因的表达、肿瘤细胞生长和凋亡所受到的影响。方法:设计并合成Sox9(siRNA),鉴定后将其转染HTB-94肿瘤细胞,观察肿瘤细胞的Sox9基因的mRNA和蛋白表达的变化,以及被转染肿瘤细胞的生长曲线和肿瘤细胞凋亡的情况。结果:Sox9(siRNA)的插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致,被转染的HTB-94Sox9基因的mRNA的表达量下降了35.4%,蛋白的表达量下降了31.3%;Sox9(siRNA)转染HTB-94细胞24h和96h的光吸收值分别为0.146±0.037和0.412±0.036,而正常对照细胞组两个同样时间段的光吸收值分别为0.152±0.0367和0.607±0.029。其中细胞生长增殖速度的差异为32.0%,肿瘤细胞的生长明显受到抑制;Sox9(siRNA)转染HTB-94细胞的干扰组细胞凋亡率为39.2%;而未经干扰的HTB-94肿瘤细胞的细胞凋亡率为0.1%。结论:经过设计合成的Sox9(siRNA)表达质粒可以稳定转染人体软骨肉瘤细胞HTB-94肿瘤细胞,被Sox9(siRNA)表达质粒转染的人体软骨肉瘤细胞HTB-94肿瘤细胞Sox9基因的mRNA和蛋白的表达都受到抑制,同时肿瘤细胞的生长繁殖也受到明显抑制,肿瘤细胞的凋亡明显增加。

骨髓间充质干细胞实验室分离的方法

目的:探讨实验室中简单实用,准确有效的骨髓间充质干细胞的分离方法,为其组织工程的临床应用创造最佳选择。方法:选用1月龄新西兰兔,自胫骨上端抽取骨髓血,分别用Percoll分离液;全血细胞培养法;淋巴细胞分离液以及0.17mol/L氯化铵溶液分离培养兔骨髓间充质干细胞,观察分离细胞的含量以及生物活性。结果:2周后Percoll分离液法细胞含量明显高于全血细胞培养法,淋巴细胞分离液未分离出骨髓间充质干细胞,0.17mol/L氯化铵溶液12次实验中仅有1次分离出少量细胞。结论:Percoll分离液和全血细胞培养法为有效的骨髓间充质干细胞分离方法。

兔骨髓间充质干细胞经Ad-TGFβ1重组腺病毒载体转染定向分化为软骨细胞

目的:通过软骨组织工程与基因治疗相结合的技术,利用腺病毒载体将转化生长因子β1基因导入兔骨髓间充质干细胞,使其诱导靶细胞定向分化为软骨细胞。方法:实验于2004-03/2006-03在徐州医学院完成。①实验方法:兔麻醉后自胫骨上端抽取骨髓,体外分离培养骨髓间充质干细胞。取第2代细胞,以1×104/cm2接种,达70%融合时分为3组:Ad-TGFβ1转染组采用H-DMEM无血清培养基,加入刚解冻的Ad-TGFβ1液30μL,地塞米松100nmol/L,维生素C50mg/L;Ad-GFP对照组采用H-DMEM无血清培养基,加入Ad-GFP腺病毒,地塞米松100nmol/L,维生素C50mg/L;空白对照组采用H-DMEM完全培养基,不外加任何试剂或药品。②实验评估:倒置显微镜逐日观察细胞生长情况。分别于转染后7,14,21,28d检测细胞内蛋白多糖、转化生长因子β1、Ⅱ型胶原的表达。结果:①细胞形态学观察:Ad-TGFβ1转染后7d,集落中的细胞呈放射状向周围扩展,均一性好,呈长梭形,紧密排列似漩涡状,生长速度明显增快,细胞密度明显增高。②转染后细胞内蛋白多糖的检测:Ad-TGFβ1转染后14d胞浆呈紫蓝色,异染性明显,胞核清晰,可见核仁。转染后28d细胞明显老化,但胞浆中仍可见紫蓝色异染。其余两组均未见明显的异染性。③转染后转化生长因子β1的表达:Ad-TGFβ1转染组细胞中转化生长因子β1呈强阳性表达,其余两组几乎检测不到转化生长因子β1的表达。④转染后细胞内Ⅱ型胶原的表达:Ad-TGFβ1转染后7d胞浆中Ⅱ型胶原呈弱阳性表达,转染后14,21d呈强阳性表达,转染后28d表达有所降低。其余两组几乎不表达Ⅱ型胶原。结论:经Ad-TGFβ1重组腺病毒载体转染,兔骨髓间充质干细胞可定向分化为软骨细胞,是获得软骨组织工程种子细胞的方法之一。

尼古丁对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性的抑制作用

目的:通过观察尼古丁对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶及生物活性的影响,探讨其对骨折愈合的作用机制。方法:不同含量的尼古丁硫酸盐作用于兔骨髓间充质干细胞,分别在1,3,5,7d时测定碱性磷酸酶活性,于3周时测定细胞生长数及细胞集落形成单位(colonyformingunit,CFU)。结果:尼古丁硫酸盐含量0.05g/L第7天的碱性磷酸酶活性为20.26,0.1g/L第5天时为18.46,0.2及0.4g/L第3天时分别为20.27和19.06,碱性磷酸酶活性的变化差异开始有显著性意义P<0.01),且(碱性磷酸酶活性随尼古丁含量的增高及作用时间的延长而逐渐降低,而3周后测定的细胞数及CFU差异无显著性意义。结论:尼古丁抑制骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性,并表现出对浓度和时间的依赖性,而对细胞生长形态以及细胞集落形成单位无明显影响。

内固定钢板治疗不稳定型挠骨远端骨折的疗效分析

目的探讨多种内固定钢板治疗不稳定型挠骨远端骨折手术疗效。方法比较国内外先进的不同种材料钢板治疗挠骨远端骨折的手术方法。结果多种不同种材料型号钢板以及配合外固定支架治疗挠骨远端骨折都达到满意的治疗效果。结论不稳定型挠骨远端骨折有众多的亚型,必须根据具体的骨折类型选择不同种的内、外固定手术方法。

软骨肉瘤细胞Caspase-3表达及其与相关基因相互作用的研究

目的:研究肿瘤基因Caspase-3与PTHrP和Sox9在人体软骨肉瘤细胞HTB-94中的相互作用机制。方法:小干扰siRNA分别阻断PTHrP和Sox9后,检测肿瘤细胞中Caspase-3的mRNA和蛋白表达。结果:PTHrP基因被干扰后,Caspase-3的mRNA表达增加了57.7%,蛋白的表达增加了57.1%;Sox9基因被干扰之后,Caspase-3的mRNA表达增加了47.4%,蛋白的表达增加了48.2%。结论:肿瘤基因Caspase-3在软骨肉瘤细胞中的表达与软骨肉瘤相关基因PTHrP和Sox9有关,可能是位于PTHrP和Sox9的下游基因。

兔骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原表达的实验研究

目的探讨兔骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原的实验研究方法。方法利用β1转化生长因子腺病毒表达载体(Ad-TGFβ1)转染兔骨髓间充质干细胞(MSCs),观察转染后的Ⅱ型胶原表达。结果细胞转染后Ⅱ型胶原在免疫印记和免疫组化检测下均呈强阳性表达。结论Ad-TGFβ1转染兔骨髓MSCs可使其细胞内Ⅱ型胶原表达阳性。

半腱股薄肌腱与腓肠肌内侧头重建膝关节肿瘤假体伸肌装置

目的探讨膝关节肿瘤假体置换术后伸肌装置重建的手术治疗方法。方法总结回顾自2004年1月～2006年5月施行的5例利用半腱股薄肌腱重建伸肌装置的膝关节肿瘤假体置换术,观察比较手术疗效。结果患者术后膝关节功能恢复良好,可自主伸屈膝关节至功能位。结论半腱股薄肌腱重建膝关节肿瘤假体置换术后的伸肌装置,取材简单,肌腱强度大,是一种理想的手术方法。

AO肩锁钢板钩治疗重型肩锁关节脱位

目的 评估AO肩锁钢板钩治疗重型肩锁关节脱位的手术疗效。方法 回顾性分析两年来27例手术病人的手术治疗和疗效。结果 手术方法符合生理结构,手术时间平均30分钟,内固定牢靠。根据Murley和Constant评分,优良率94％。结论 AO肩锁钢板钩治疗重型肩锁关节脱位,手术方法简单,疗效可靠,允许病人术后早期功能锻炼。

PTHrP基因靶向RNA干扰重组表达质粒的构建鉴定以及在HTB-94细胞中的功能检测

目的构建针对目的基因PTHrp的pSilencer3.1-H1neo siRNA(small interfering RNA)表达质粒,并在人体软骨肉瘤细胞HTB-94中观察其干扰效果。方法设计并合成针对PTHrP基因编码区的含有发卡结构的互补的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BamHⅠ,HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1H1neo中,对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定。结果双酶切证实PTHrP siRNA表达质粒克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致,同时干扰了PTHrP基因的mRNA和蛋白的表达。结论成功构建的靶向RNA干扰重组表达质粒,可以通过小RNA序列干扰靶向基因的mRNA转录,降低靶向基因在细胞中mRNA和蛋白的表达。

外固定支架治疗骨盆骨折的作用机制

To investigate the treatment of extemal fixator for unstable pelvic fracture.Methods To compare the different results in 78 patients treatment with and without extemal fixator. Results In 38 cases treated without extemal fixator the hypovolume shock cure rate was 76%, the average blood transfusion rate was 3800ml, the average ISS score 11.6. In 40 cases treated by extemal fixator the hypovolum shock cure rate was 90%, the average bled transfusion rate was 2100ml, the average ISS score 9.8. Conclusion The treatment for unstable pelvic fracture with external fixatory is simple and relible,which may reduce the blood loss rate significantly.

人工髋关节翻修的股骨假体柄的形态及稳定性的临床观察

目的 ：根据全髋关节翻修所得资料,分析人工股骨柄在生理应力作用下的状态,讨论延长人工关节使用年限的注意事项,为临床工作积累更多经验。方法：选择53例单侧全髋关节置换术后需要行翻修手术的患者,其中男28例,女25例;平均年龄74.66岁（61~84岁）。人工关节平均使用年限18.24年（3~27年）,首次置换术后初始下地负重时间平均11 d（5~16 d）,翻修的主要原因为自发松动和外伤。根据患者影像学资料和手术直观所见进行分析,并根据组织学病理做出推断。结果：股骨柄假体在生理应力下存在微动沉降,其二次稳定与股骨柄设计、患者动态、骨质和骨长入性状有关。直柄假体有利于生理性沉降,实现紧密接触的骨长入稳定,可以在患者条件允许下早期负重锻炼。有领假体和结合内固定假体限制股骨柄沉降,其稳定性取决于首次安置时的压配和后期骨长入支撑,对该类患者建议延长非负重时间。结论：根据患者实际情况,选择恰当的股骨假体和下地负重时机可以延长股骨假体的使用年限,减少松动概率。

影响脊髓型颈椎病远期预后的相关因素分析

目的:探讨年龄、病程、MRI(脊髓受压程度、髓内信号)和皮层体感诱发电位(cortical somatosensory e-voked potential,CSEP)变化对脊髓型颈椎病(cervical spondylotic myelopathy,CSM)手术预后的影响。方法:选择颈前路减压植骨整合钛制带锁螺钉钢板固定治疗的28例CSM患者进行回顾性分析。年龄35～71岁,平均49.6岁;病程4个月～2年,平均18个月。分别依患者的年龄、病程、MRI(脊髓受压程度及有无信号异常)和CSEP等因素进行分组,根据日本矫形外科学会(JOA)制定的脊髓功能评分标准评价患者术后脊髓功能状态,分析各因素与脊髓型颈椎病手术预后的关系。结果:随访1.5～3年,平均2.3年。年龄>60岁与年龄≤60岁术后JOA评分差异有统计学意义(P<0.05),病程>6个月与病程≤6个月术后JOA评分差异有统计学意义(P<0.05),脊髓受压<1/3与脊髓受压≥1/3者术后JOA评分差异有统计学意义(P<0.05),MRIT2加权像和T1加权像信号正常者与T2加权像高信号者术后JOA评分差异有统计学意义(P<0.05),T2加权像高信号、T1加权像信号正常者与T2加权像高信号伴T1加权像信号减弱者术后JOA评分差异有统计学意义(P<0.01),CSEP正常者与异常者术后JOA评分差异无统计学意义(P>0.05)。结论:观察患者的年龄、病程、脊髓受压程度、髓内有无信号异常有助于预测CSM脊髓功能的预后,而不能仅依CSEP判断脊髓的功能状态。

Halo-vest支架对急性颈椎骨折及脱位的治疗意义

目的 评价Halo-vest支架对急性颈椎骨折及脱位的治疗意义.方法 回顾分析2000年1月至2005年12月,共计12例急性颈椎骨折及脱位患者应用Halo-vest支架复位固定治疗的效果.结果 12例患者经6～48个月随访,Halo-vest支架固定62-128天,平均96天,X片显示椎体骨折患者骨折全部愈合,4例患者椎体骨折愈合后椎体高度较正常略扁,6例椎体脱位患者复位固定后无明显脱位.3例伴有轻度神经压迫症状患者症状消失.结论 Halo-vest支架治疗急诊外伤造成的颈椎骨折及脱位,简单,安全,有效,经济,是治疗急性颈椎骨折及脱位的一种较好的治疗手段.

股骨上端表面压应力和折弯应力的生物力学研究

目的 ：实体测试股骨上端生物力学分布情况,了解骨质极限应力状态,为临床工作积累更多经验。方法 ：选择60例新鲜中国人尸体骨股,去除表面肌肉、韧带等组织,供体年龄36~72岁,平均56.4岁,其中男性41根,女性19根,随机分为两组,分别在力学专业实验室以专业设备进行压应力和折弯应力的力学测试,搜集单位应力下各测点的受力值。结果：股骨上端耐受压应力的能力较耐受折弯应力强,压应力主要受力区域为股骨颈基底部内外侧和小粗隆截面内侧;折弯应力主要受力区域为股骨颈基底后侧以及小粗隆截面后侧。主要受力区域有较强的骨质强度,目前主流的粗隆骨折内固定物和人工股骨柄均以此为生物力学基础设计。结论：本研究结果显示的数据未查到既往文献报道,可以为内固定物和股骨柄改进提供资料。临床上需要针对试验结果选择合适的骨折内固定和人工股骨柄,更完善的数据结果需要远期深入的研究。

胫骨髁间嵴撕脱骨折的关节镜治疗

目的 探讨关节镜下治疗胫骨髁间嵴撕脱骨折的微创治疗方法及疗效。方法 首先在关节镜监视下行骨折复位,然后利用前交叉韧带导向器准确定位,钻2个平行骨孔,可吸收缝线横穿前交叉韧带基底部并经骨孔引出关节外打结、固定。结果 全部患者均获得随访,随访时间3～18个月,平均11.2个月。X线片示骨折全部愈合,所有病例均获正常活动范围。结论 关节镜手术治疗胫骨髁间嵴撕脱骨折,创伤小,简便易行,疗效可靠,是治疗此类骨折的理想方法。

超高分子聚乙烯颗粒对体外培养成骨细胞活性的影响

目的建立小鼠胚胎成骨细胞和超高分子聚乙烯(UHMWPE)颗粒的体外联合培养的新模型,初步研究超高分子聚乙烯颗粒对成骨细胞活性和核心结合因子α1(Cbfα1)表达的影响。方法分为空白对照组和UH-MWPE颗粒干预组,2组常规培养小鼠胚胎成骨细胞,待细胞贴壁后装满培养基,UHMWPE颗粒干预组加入UH-MWPE颗粒,封闭倒置培养瓶,颗粒漂浮至贴壁细胞层。应用流式细胞技术分析各组细胞早期凋亡情况。分别在共培养的第3、5、7天检测细胞Cbfα1在mRNA和蛋白水平上的表达情况。结果封闭条件下小鼠胚胎成骨细胞正常生长可达10天;UHMWPE颗粒不影响细胞增殖活性,对细胞无明显毒性作用;UHMWPE颗粒干预组的目的基因Cbfα1表达增强。结论超高分子聚乙烯颗粒可以独立、直接影响成骨细胞相关因子的分泌。

高龄患者股前外侧小切口全髋关节置换术的手术配合

老年人由于骨质疏松，骨脆性增加，在外力作用下容易发生股骨颈骨折，因愈合能力差，股骨头坏死的发生率高，全髋关节置换术是较理想的治疗方法。近年来，在全髋关节置换术基础上发展而来的小切口微创置换技术（THA）以其手术切口小、创伤小、并发症少等优点逐渐成为治疗老年股骨颈骨折的常用方法。2009年9月至2011年11月，本院骨科为31例高龄股骨颈骨折患者实施股前外侧肌小切口全髋关节置换术，临床效果良好，现将手术配合报告如下。

RNAi技术沉默PTHrP基因的表达诱导软骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的研究甲状旁腺相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对软骨肉瘤细胞增殖的影响。方法本实验设置空白对照组、空质粒组和siPTHrP转染组,每组样本数均为6。空白对照组不做处理;分别将空质粒pSilencer3.1H1neo(空质粒组)和重组质粒pSilencer3.1H1neo-siPTHrP(siPTHrP转染组)转染至SW1353软骨肉瘤细胞株,通过MTT法检测各组细胞活力并绘制细胞生长曲线,利用流式细胞技术测定细胞凋亡率,半定量RT-PCR和Western blotting法检测PTHrP基因在mRNA水平及蛋白水平表达上的变化。结果siPTHrP转染组的细胞生长较空白对照组软骨肉瘤细胞明显缓慢;siPTHrP转染组细胞凋亡率明显升高;重组质粒pSilencer3.1H1neo-siPTHrP能明显抑制软骨肉瘤细胞的PTHrP基因在mRNA转录水平和蛋白水平上的表达。结论重组质粒pSilencer3.1H1neo-siPTHrP可明显抑制软骨肉瘤细胞增殖及其内源基因PTHrP在mRNA转录水平和蛋白水平的表达,为PTHrP介导的软骨肉瘤基因沉默疗法提供了理论基础。