2型猪圆环病毒感染对小鼠组织中Caspase3、Bak及Bcl-2基因表达的影响

Caspase3、Bcl-2、Bak是细胞凋亡过程中3种重要的调节蛋白,为研究感染猪圆环2型病毒(PCV2)后体内细胞的凋亡情况,本实验以BALB/c小鼠为实验模型,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测细胞凋亡的方法。结果表明实验组Caspase3的表达在各时间段里与对照组相比均呈上升趋势,提示了PCV2感染可以上调Caspase3水平,从而增加被病毒感染组织的细胞凋亡,而小鼠心、脑、脾等组织Bak基因表达明显上调,Bcl-2基因表达水平也伴随Bak基因而升高。这些结果揭示了PCV2感染BALB/c小鼠后,相关细胞凋亡基因在体内的作用与机制,同时为今后细胞凋亡的检测提供了新的方法。

4株PRRSV GP5蛋白编码序列的序列测定和特性分析

针对PRRSV ORF5基因组设计了1对特异性引物,利用RT-PCR的方法,对在南方地区分离的4株PRRSV ORF5基因进行了基因扩增,克隆到pMD18-T载体后测序,获得了4株PRRSV ORF5基因全长603bp的核苷酸序列。利用生物信息学软件对4株PRRSV ORF5基因序列进行了遗传进化分析,结果显示GD1、GD2、GD3、GD4株与美洲型参考株(VR-2332)的核苷酸序列同源性分别为87.1%、87.2%、87.1%和86.9%。利用系统进化树分析表明GD1、GD2、GD3、GD4株均属于美洲型。进一步采用序列分析软件对病毒结构蛋白推导糖基化位点比较,结果表明不同毒株GP5糖基化位点在基序和位置上均有所不同,这可能与毒株的毒力、免疫原性的差异相关,这些为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据,同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。

猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法的研究

本研究介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增(LAMP)基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中2对特殊引物,并在Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应。本研究对LAMP反应体系和反应条件的优化,结果表明PCV-2 LAMP在63℃1 h内能够成功的检测猪圆环病毒2型基因;敏感性和特异性试验表明,本研究能够特异的检测PCV-2并且其敏感度可以达到10个拷贝的DNA分子,初步研究LAMP的阳性检出率与PCR的阳性检出率比较结果为94%符合。以上结果证明,LAMP扩增技术是一种检测程序简便、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在猪圆环病毒2型的快速检测方面具有一定的开发潜力。

猪生殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法的建立

针对美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了一套RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为10个拷贝,而RT-PCR的最低检出限为1×104个拷贝。分别用建立的RT-LAMP法与RT-PCR法对临床50份样品进行检测,结果二者的符合率在96%以上,呈现很好的一致性。表明,建立的RT-LAMP法可应用于PRRSV的快速检测。

猪繁殖与呼吸综合征病毒各结构蛋白的融合表达

本研究以测序质粒为模板,扩增出结构蛋白基因ORF2a-ORF7,将此基因片段插入真核表达载体pEGFP-N3中构建重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7),然后将重组表达质粒转染293T细胞。通过荧光显微镜观察显示,重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7)和载体pEGFP-N3均有绿色荧光出现。SDS-PAGE电泳和western blot分析结果表明重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7)和载体pEGFP-N3均有EGFP表达;仅ORF7有43ku的融合蛋白EGFP出现,与预期大小相符;其他重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF6)均没有融合蛋白出现。本实验为进一步研究这些蛋白的结构和生物学功能奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒XH株感染性克隆的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统,本实验采用RT-PCR方法将PRRSV-XH株的基因组序列分为6个片段进行扩增,连接至低拷贝载体pOKQ中,获得全长cDNA克隆。将该克隆体外转录,经脂质体转染Marc-145细胞,观察细胞病变。经RT-PCR、间接免疫荧光和western blot等试验验证,表明构建了具有感染性的PRRSV-XH株全长cDNA克隆。本实验为在分子水平上研究PRRSV的复制、致病机理和基因产物的功能等方面提供技术支持,并为构建新型病毒载体和开发安全有效的活病毒疫苗奠定基础。

猪圆环病毒2型广东株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪圆环病毒2型（PCV2）全基因组序列，设计2对特异性引物，对广东省不同地区规模化猪场采集的疑似断奶仔猪多系统消耗综合征（PMWS）组织病料进行了PCV2全基因组克隆和序列分析．结果表明，PCV2核苷酸序列较稳定，不同地区6个PCV2毒株全基因组序列均由1767bp组成，彼此间核苷酸序列相似性达95．3％～99．8％，亲缘关系密切；与GenBank已发表的国内不同地区PCV2参考毒株的相似性介于70．1％-99．1％；与欧洲各地区毒株的相似性介于67．7％～98．8％；其中与美国的毒株（AY094619）差异性最大，介于69．4％-70．8％之间．

PRRSV变异株ORF6基因重组杆状病毒的构建及其在昆虫细胞的表达

参照GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XH-GD株ORF6(M蛋白)基因序列,设计合成了一对引物,扩增PRRSV ORF6基因。将该基因克隆于转移质粒载体pFcDNA3.1(+)中,获得重组转移质粒pFcDNA3.1-ORF6并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-ORF6,再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBacmid-ORF6,经PCR鉴定证实目的基因正确地插入到杆状病毒基因组的CMV启动子下游;经过间接免疫荧光试验(IFA)检测,M蛋白在Sf9细胞中得到了表达,而且表达的产物具有特异免疫学反应性。

猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5重组杆状病毒疫苗的研究

参照GenBank上收录的基因组序列自行设计引物,分别扩增猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5。将外源基因分别插入经改造的杆状病毒穿梭载体pFVC,获得3种重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2。将重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2分别转入带有杆状病毒骨架的DH10BacTME.coli感受态细胞中。提取高质量的重组质粒rBacmid-ORF2、rBacmid-ORF5、rBacmid-ORF5-ORF2,将重组质粒转染Sf9细胞,获取重组病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2。通过间接免疫荧光检测证实了外源基因正确表达。重组杆状病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2对BALB/c小鼠的免疫试验结果显示,rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2均能够刺激小鼠机体产生免疫应答,产生抗体,并能持续较长时间。

CO_2敏感型聚合物及其在药物控释领域的研究进展

刺激响应性材料被广泛应用于药物控释领域。作为一类新型的刺激响应性材料,CO_2敏感型聚合物是目前研究的热点。为此,本综述简单回顾了近10年来CO_2敏感型聚合物的研究进展,并介绍了其在药物控制释放领域的应用情况。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank收录的PRRSV基因序列,利用PRRSV经典变异株与缺失变异株NSP2基因序列特点,设计合成两对特异性引物,经RT-PCR扩增后,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,并转化到大肠杆菌DH-5a株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV缺失变异株与经典变异株的阳性重组质粒。将重组标准质粒进行10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR法(Real-timePCR),建立了PRRSV缺失变异株与经典变异株的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为鉴别诊断及分析PRRSV缺失变异株与经典变异株感染猪体内病毒的绝对含量提供了技术手段。

犬子宫内膜炎的早期诊断与治疗

犬的子宫内膜炎是引起犬不孕症的主要原因之一。文章结合临床病例对子宫内膜炎的概念、病因,症状及实验室诊断进行了探讨,重点讨论了应用B超进行早期诊断、中西医结合治疗及新中药应用等治疗方法。

猪繁殖与呼吸综合征病毒广州株的分离鉴定与全基因序列分析

为了给研制基因工程疫苗选取毒株奠定基础,研究在2008年采集广东省某猪场疑似猪高热症病料1份,通过RT-PCR检测、Marc-145细胞传代,证实分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒,命名为PRRSV-GZ株,经过扩增基因序列并测序,绘制遗传进化树,结果表明:PRRSV-GZ株属于美洲缺失型毒株。

广东地区猪源戊型肝炎病毒的检测和核苷酸序列分析

为了检测广东地区部分猪场猪群中的猪源戊型肝炎病毒(HEV)RNA,试验利用反转录巢式聚合酶链式反应(RT-nPCR)并应用生物学软件将经扩增和测序得到的猪源HEV核苷酸序列与GenBank上的各个基因型HEV进行相似性比较分析。结果表明:5个样品中检测到HEV RNA,它们的相似性为85.1%～96.3%,与GenBank上基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型HEV序列的相似性分别为76.1%～80.5%、76.5%～79.4%、76.4%～80.2%、82.1%～97.7%。说明广东地区存在的猪源HEV可能属于在国内猪群中流行的基因Ⅳ型。