无PAM限制的CRISPR/Cas9系统构建及效率验证

CRISPR/Cas9系统在进行靶向基因敲除、转录激活以及抑制时,需要通过识别Cas9靶位点上的一个原间隔子相邻基序(PAM)序列进行特异性靶向基因编辑。现阶段,被广泛认可的化脓性链球菌SpCas9仅识别比较短的PAM为NGG(N为任意碱基,G为鸟嘌呤)。本实验在野生型SpCas9、PAM为NG的xCas9和SpCas9-NG的基础上,构建预期PAM为NNG的突变体SpCas9NNG、预期PAM为NNN的突变体xCas9NNN和ngCas9NNN,通过双荧光素酶报告基因检测评价其切割活性。结果显示:本次实验构建的ngCas9NNN突变体对PAM为NNN的靶标DNA具有显著的切割活性,为后续拓宽CRISPR/Cas9系统的靶向范围提供重要参考。

CRISPR/AsCpf1双切刻系统构建初探

为了在CRISPR/AsCpf1系统的基础上构建双切刻系统,提高基因编辑特异性,本研究设计并构建Cpf1n(R1226A)、Cpf1-RRA(S542R/K607R/K949A)、Cpf1-RRAA(S542R/K607R/K949A/R1226A)3个突变体以及相应的crRNA表达载体,通过特定质粒组合与SSA-DKK2报告质粒共转染绵羊成纤维细胞,通过双荧光素酶检测的方式来验证DNA切割效率。结果显示:针对TTTV PAM的CRISPR/AsCpf1双切刻系统有DNA双链切割活性,但是单个的AsCpf1切口酶的DNA双链切割活性并未完全丧失;AsCpf1-RRA突变体针对TYCV PAM靶标具有一定的DNA双链切割活性;AsCpf1-RRAA突变体没有检测到针对TYCV PAM靶标的DNA双链和单链切割活性,但可能保留了DNA结合能力。本研究结果为后续高效CRISPR/Cpf1双切刻系统的开发与改进提供了重要参考。