含p53保守结合位点的microRNA表达载体的构建及应用

目的:构建含p53保守结合位点的microRNA(miRNA)表达载体,促进相关miRNA在具有野生型p53蛋白细胞中的高效表达。方法:改构miRNA表达载体pCMV-miR,在其多克隆位点前插入p53保守结合位点,分别将miR-138、miR-34a和miR-21前体序列pre-miR-138、pre-miR-34a和pre-miR-21插入上述改构的载体pCMV/p53-miR,将构建的pCMV/p53-miR-138、pCMV/p53-miR-34a和pCMV/p53-miR-21表达载体转染具有野生型p53的HeLa细胞和不表达p53的H1299细胞,分析p53对上述miRNA表达调控的影响。结果:转染改构的miRNA表达载体后,HeLa细胞中miR-138、miR-34a和miR-21的表达水平明显提高,它们对应的已知靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的表达同时被显著下调。结论:在p53转录调控作用下,具有p53保守结合位点的miRNA表达载体能够更加有效地提高miRNA的表达水平;构建的载体不但可用于促进相关miRNA的表达,也能用于miRNA是否受p53调控的检测。

MicroRNA及其靶基因的时空特异性与动态变化

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动植物中大小约22nt的内源单链非编码小RNA分子,通常在转录后水平负调控其靶基因的表达,在机体生命活动的各个过程中(如细胞增殖和分化、凋亡、疾病的发生发展等)发挥着重要的调节作用.越来越多的研究表明,miRNA的表达具有时序特异性和组织特异性.每种miRNA针对的数个甚至上百个潜在靶基因,在不同的细胞或同一细胞的不同状态下是否能发挥功能性靶标的作用也有所不同.这些研究结果不但说明miRNA及其靶标具有时空动态变化的特性,而且也提示miRNA在机体内发挥作用的复杂性.本文就miRNA及其靶标时空动态变化的相关研究进展做一综述,期望对深入了解miRNA的功能提供新的思路.

H1299细胞中miR-138的功能性靶标动态变化与mRNA核／质比一致性研究

目的确定miRNA功能性靶基因的动态变化与mRNA核／质比的一致性。方法利用质／核比基因表达谱芯片和实时荧光定量PCR技术．研究转染miR-138的H1299细胞饥饿不同时间后生物信息学预测的miR-138靶基因变化与其相应基因核／质比的关系。结果H1299细胞中miR-138的功能性靶标动态变化规律与mRNA核／质比一致性较好。结论miRNA的功能性靶标是随着细胞的状态不同而发生动态变化。

miR-1273g-3p通过靶向CNR1调节A549细胞迁移能力

目的寻找hsa-miR-1273g-3p在人肺腺癌细胞A549中的特异性靶标并探索其生物学功能。方法定量PCR（qPCR）检测miR-1273g-3p在人肺癌细胞A549、H460和H1299中表达情况，利用生物信息学方法预测miR-1273g-3p靶基因，qPCR、免疫印迹（Western Blot）和荧光素酶实验确证靶标，划痕实验和MTS实验验证miR-1273g-3p的生物学功能。结果miR-1273g-3p在非小细胞肺癌细胞系A549、I-1460和H1299中高表达：qPCR、Western印迹和荧光素酶实验证实miR-1273g-3p能够靶向CNR1，可以在mRNA与蛋白水平上调控CNR1的表达；miR-1273g-3p能够通过改变CNR1的表达水平影响A549的细胞迁移能力，对细胞增殖影响不明显。结论研究证明CNR1是miR-1273g-3p的靶基因，揭示miR-1273g-3p通过靶向CNR1影响A549细胞迁移的新功能。

PSM-E抑制炎性细胞因子分泌及单核细胞趋化的功能研究

目的探索在前列腺癌中前列腺特异性膜抗原(PSMA)的新型剪切变异体PSM-E对炎性细胞因子的分泌,及其对单核细胞趋化的影响。方法采用免疫组织化学染色法检测110例原发性前列腺癌组织中PSM-E与肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表面特异性蛋白CD206的表达。用siRNA转染LNCaP细胞干扰PSM-E的表达作为实验组,对LNCaP细胞转染对任何基因无干扰作用的siRNA作为对照组。利用佛波酯和白细胞介素-4(IL-4)刺激单核细胞THP-1诱导其分化为M2型TAMs。将M2型TAMs分别与实验组和对照组LNCaP细胞共培养72 h后,收集培养基上清,采用炎症因子芯片检测共培养系统中细胞因子的变化。将单核细胞系THP-1分别与实验组和对照组LNCaP细胞共培养72 h后,结晶紫染色观察单核细胞趋化情况。结果110例原发性前列腺癌组织中,PSM-E呈高表达的阳性率为54.5%(60/110),CD206呈高表达的阳性率为58.1%(64/110)。Spearman相关性分析结果显示,以免疫组化评分为指标,PSM-E与CD206表达呈负相关(r=-0.5,P<0.01)。成功构建PSM-E敲低的前列腺癌LNCaP细胞模型和M2型TAMs细胞模型(THP-1来源)。与阴性对照组相比,PSM-E敲低细胞组的PSM-E的mRNA水平表达量显著降低(P<0.05);与M0型巨噬细胞相比,M2型TAMs细胞标志物基因CCL17、CCL18、CCL22的表达显著增高(P<0.05)。与对照组相比,将敲低PSM-E的前列腺癌LNCaP细胞与TAMs共培养后,细胞培养上清中的干扰素γ诱导的T细胞α型趋化因子(ITAC)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Fractalkine、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、MIP-1β、MIP-3α、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-4、IL-7、IL-8、IL-10、IL-13、IL-21、IL-23炎性细胞因子均呈较强升高,提示PSM-E可抑制肿瘤微环境中炎症细胞因子的分泌。与对照组相比,将THP-1细胞与敲低PSM-E的前列腺癌LNCaP细胞共培养后,趋化的穿过培养小室的细胞数量显著增加。结论PSM-E具有抑制肿瘤微环境中炎性细胞因子的产生,进而抑制单核细胞趋化的新功能,提示PSM-E可成为肿瘤相关巨噬细胞靶向性治疗的一个新分子靶点。