人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定

目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法,提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法取2根脐带(至少20 cm)冲净淤血,采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液,一根用0.2%胶原酶Ⅱ,另一根用0.1%胶原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液,比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养,观察细胞的生长及传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点,同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周期。结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞,胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶,且比较理想的消化时间均为13 min,细胞接种后4～5 h开始贴壁生长,1周左右可生长成单层,光镜下呈多角形,"铺路石"样排列,免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法,而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液,成功率高,可靠性大,可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。

黄芩苷对TNF-α诱导下人脐静脉血管内皮细胞影响的初步研究

目的研究TNF-α和黄芩苷对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)活力的影响及黄芩苷对体外TNF-α诱导培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响。以期从血管内皮细胞的角度探讨黄芩清热安胎的机理。方法选取不同浓度的TNF-α作用于HUVEC,四甲基偶氮唑盐(3-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色实验分析TNF-α对HUVEC细胞活力的影响。选取不同浓度的黄芩苷作用于HUVEC,培养24 h后,MTT比色实验分析黄芩苷对HUVEC细胞活力的影响。选取TNF-α作用浓度10ng/ml造模及原液1000倍稀释液的黄芩苷溶液作用于HUVEC,MTT比色实验和流式细胞术分析黄芩苷对HUVEC凋亡的影响。结果 TNF-α作用后的HUVEC活性(A值)均低于于空白对照组,并且随着TNF-α浓度越大,A值越小。10、50ng/ml浓度TNF-α作用后HUVEC与空白对照组比较差异有显著性,P<0.05。黄芩苷作用后的HUVEC活性(A值)高于于空白对照组。黄芩苷作用后的HUVEC活性(A值)高于凋亡模型组,差异具有显著性,P<0.05。流式细胞术示黄芩苷作用后的HUVEC凋亡率低于凋亡模型组。结论 TNF-α明显抑制细胞增殖分裂的过程,诱导细胞凋亡。黄芩苷对HUVEC的生长增殖具有一定的促进作用。而黄芩苷对TNF-α诱导培养的HUVEC凋亡有抑制作用。

肿瘤坏死因子α诱导蜕膜细胞凋亡模型建立及黄芩苷对蜕膜细胞凋亡的影响

目的:探索建立肿瘤坏死因子诱导蜕膜细胞凋亡模型,观察黄芩苷对早孕蜕膜细胞凋亡的影响,初步分析黄芩清热安胎作用机制。方法:实验于2006-04/09在湖南中医药大学国家重点二级实验室病理生理实验室完成。取湖南中医药大学第一附属医院门诊人流手术室正常妊娠40d健康孕妇人流组织,患者知情同意。体外常规进行蜕膜细胞培养,选取经鉴定的4、5代细胞蜕膜细胞,用不同浓度(0.5,2.0,10.0,50.0μg/L,共设4组,并设空白对照组)的肿瘤坏死因子α作用于蜕膜细胞,四甲基偶氮唑盐比色实验分析肿瘤坏死因子α对蜕膜细胞活力的影响,荧光细胞染色观察确定蜕膜细胞凋亡模型的建立。选取适宜浓度的黄芩苷作用于正常蜕膜细胞及肿瘤坏死因子α诱导的凋亡蜕膜细胞(设肿瘤坏死因子α模型组,黄芩苷组,肿瘤坏死因子α加黄芩苷组,并设空白对照组),培养24h后,四甲基偶氮唑盐比色实验分析黄芩苷对蜕膜细胞活力的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:实验成功获取足够量的细胞,经泌乳素免疫组化鉴定为较高纯度的蜕膜细胞。①肿瘤坏死因子α作用后的蜕膜细胞活性均低于空白对照组,并且随着肿瘤坏死因子α浓度越大,活力越小。10.0,50.0μg/L肿瘤坏死因子α作用后蜕膜细胞活性与空白对照组比较,差异有显著性意义[(0.196±0.040),(0.106±0.020),(0.317±0.020),P<0.05]。但50.0μg/L时经形态学观察有部分细胞漂浮、死亡。②肿瘤坏死因子α模型组蜕膜细胞活性低于黄芩苷组和肿瘤坏死因子α加黄芩苷组,差异具有显著性意义[(0.27±0.03),(0.49±0.01),(0.38±0.02),P<0.05]。③流式细胞术示空白对照组蜕膜细胞凋亡率低于其他各组,差异均有显著性意义[(1.48±0.45)%,(16.40±0.82)%,(9.78±0.26)%,(10.96±0.92)%,P<0.05]。在荧光显微镜下,肿瘤坏死因子α作用后凋亡的蜕膜细胞细胞核变小皱缩,可见致密强荧光。结论:肿瘤坏死因子α能明显抑制人蜕膜细胞增殖分裂的过程,诱导该细胞凋亡,可用于人蜕膜细胞凋亡模型的建立。而黄芩苷对肿瘤坏死因子α诱导的蜕膜细胞凋亡具有一定对抗抑制作用。

尤昭玲教授临床安胎思路及用药经验

尤昭玲教授系湖南中医药大学博士研究生导师,湖南中医药大学第一附属医院主任医师,享受国务院政府特殊津贴专家,国家第四批名老中医。从事中医和中西医结合妇产科临床、教学、科研30余年,在中医妇科领域造诣颇深,擅长治疗妇科疑难杂症,尤其对妇科血症、

中西医治疗排卵障碍性不孕症的研究进展

不孕症为妇科临床常见的疾病、疑难病。排卵障碍为导致女性不孕症的重要影响因素之一,其致病机制复杂。本文通过总结近年来采用中医治疗排卵障碍性不孕症的综述类文章,涵盖了中医病因病机、中医治疗现状(包括辨证论治、调周法、针灸结合以及单纯艾灸)、西医病因病机、西医的治疗方式(药物促排卵、辅助生殖技术),以期为临床指导治疗。

寿胎丸含药血清对人早孕滋养细胞Notch/Jagged信号通路相关基因表达的影响

目的 探讨寿胎丸含药血清对人早孕滋养层Notch/Jagged信号通路相关基因的表达的影响,探究寿胎丸维持妊娠的机制。方法 体外分离培养的人早孕滋养层细胞,以不同浓度(5%、10%、20%)寿胎丸含药血清干预24h,设置地屈孕酮含药血清为阳性对照组,阴性血清为空白对照组。采用RT-PCR检测Notch/Jagged信号通路相关基因的表达情况。结果 与阴性血清组相比,寿胎丸中剂量和高剂量含药血清组Notch1,Notch4,Jagged-1,Jagged-2基因表达明显升高(P<0.05),寿胎丸低剂量含药血清组虽然也有所升高,但是除Jagged1有统计学意义(P<0.05)外,其他三个基因差异没有统计学意义;与空白对照组相比,地屈孕酮中剂量组Notch1,Notch4,Jagged-1,Jagged-2均有一定程度的升高(P<0.05)。结论 寿胎丸含药血清可以通过正向调控Notch/Jagged信号通路基因的表达,促进滋养细胞的增殖和活化。

菟丝子含药血清对TNF-α诱导下人蜕膜细胞凋亡的影响

目的:通过菟丝子含药血清对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人体外培养蜕膜细胞凋亡的影响,以期从蜕膜细胞凋亡角度探讨菟丝子可能的安胎机制。方法:体外培养人蜕膜细胞,通过TNF-α诱导蜕膜细胞凋亡,菟丝子含药血清干预,MTT比色实验分析TNF-α及菟丝子含药血清作用后人蜕膜细胞活力,并用流式细胞术分析菟丝子含药血清对人蜕膜细胞凋亡的影响。结果:TNF-α作用后的人蜕膜细胞活性均低于空白对照组,随着TNF-α质量分数的增加,活性越来越小;10,50μg/L的TNF-α作用后,与空白对照组对比,差别有统计学意义(P<0.05)。200 m L/L菟丝子含药血清干预后的人蜕膜细胞活性高于TNF-α凋亡模型组,差别有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术示菟丝子含药血清作用后的人蜕膜细胞凋亡率低于凋亡模型组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:TNF-α能降低体外培养人蜕膜细胞活力,诱导细胞凋亡;菟丝子含药血清对TNF-α诱导培养的人蜕膜细胞凋亡有一定抑制作用。

《陈素庵妇科补解》调经之特色

《陈素庵妇科补解》以调经门开篇,有大量方论专述调经,可见陈沂对调经之重视,故就其调经之特色作一探讨。

妊娠免疫耐受机制的研究认识

妊娠过程是一个非常复杂而又协调的过程,胚胎作为一种半同种异体抗原组织,却未受到母体的排斥而存活,这就是妊娠免疫耐受作用,但其机理至今仍不明了,有多种机制试图解释这种现象。本文就最近对妊娠免疫耐受机理的一些研究认识作一综述。

中药阿胶的开发研究进展

阿胶为我国传统的补血中药,已有几千年的应用历史,由于其独特广泛的药理功能和良好的临床疗效,受到人们广泛的关注和开发研究。文章就阿胶提取工艺、炮制、鉴定方法、药理研究及剂型等方面的开发研究作一综述。

蛋白质组学对中医药现代化研究的思考

中医药现代化是中医药发展的趋势,如何实现中医药的现代化,是近年来我国医学关注和研究的热点问题,随着21世纪生命科学的发展,尤其是后基因组时代的到来,人们将更多的关注眼光转移到了生命的直接体现者和执行者——蛋白质,蛋白质组学时代到来了。建立在经验医学和整体认识之上的中医药,和蛋白质组学整体认识人体功能有些相似之处,借助蛋白质组学研究的技术和方法,来认识和发展中医药学,走中医药现代化之路,或许值得我们思考和借鉴。

菟丝子含药血清干预TNF-α诱导人蜕膜细胞异常凋亡后基因表达谱的变化

目的:观察菟丝子含药血清干预肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导建立人蜕膜细胞异常凋亡模型后基因表达谱的变化,以期从基因表达谱的变化探讨菟丝子安胎的分子机理。方法:体外常规进行人蜕膜细胞的培养,选用适宜浓度的TNF-α诱导建立人蜕膜细胞异常凋亡模型,用菟丝子含药血清干预,采用一步法抽提RNA,用人全基因组17Kc DNA基因芯片来分析菟丝子作用后的基因表达谱变化情况,分析基因的变化趋势。结果:菟丝子含药血清作用于TNF-α诱导的异常凋亡的蜕膜细胞后共检出基因10 230条,其中共检出表达差异基因128条,上调基因76条,下调基因52条;这些表达差异基因有细胞因子及受体、转录相关基因、凋亡相关基因、生长分化相关基因、信号转导相关基因、细胞周期相关基因、电子传递和氧化相关基因、转移酶相关基因、核酸酶相关基因等。结论:菟丝子可能通过以上基因的表达,调控蜕膜细胞的生长周期及异常凋亡,在免疫调节等方面发挥有一定的安胎作用。

社会资本视角下的大学生“亚交往圈”

在大学校园里,除学校所规定的班级、院系等正式交往圈,同学之间一直存在不同类型的“亚交往圈”。它包括社团圈、学习圈、娱乐圈、兼职圈四种“工具型”亚交往圈和寝室圈、网络圈、老乡圈、恋人圈四种“情感型”亚交往圈。大学生“亚交往圈”衍生出一种校园亚文化,成为大学生生活重要的组成部分,对大学生人格形成有重要意义。

中西医结合妇科实习生临床带教体会

带好临床实习生是教学医院老师的责任和义务。中西医结合妇科是一门实践性很强的临床学科,既具有临床各科的普遍性,又有其特殊性,中西并重,不但要突出理论的结合,还要突出临床的结合,是临床教学的重点任务,也是对中西医结合理论及实践的总结探索,总结临床带教体会,以期探索中西医结合妇科临床带教更好的方法。

菟丝子含药血清对TNF-α诱导凋亡蜕膜细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

[目的]观察菟丝子含药血清对TNF-α诱导人凋亡蜕膜细胞Bc1-2和Bax蛋白表达的影响,以期从蜕膜细胞凋亡的角度探讨菟丝子安胎的机理。[方法]体外常规进行人蜕膜细胞的培养,选用适宜浓度的TNF-α诱导建立人蜕膜细胞异常凋亡模型,用菟丝子含药血清干预,采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测对照组、模型组(TNF-α)、治疗组(TNF-α+菟丝子含药血清)凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。[结果]与对照组比较,模型组细胞促凋亡蛋白Bax的表达明显增加,抑制凋亡蛋白Bc1-2的表达明显降低,均有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,治疗组促凋亡蛋白Bax的表达明显降低,抑制凋亡蛋白Bc1-2的表达明显增加,均有显著性差异(P<0.05)。[结论]菟丝子含药血清可降低异常凋亡蜕膜细胞Bax水平,升高Bcl-2水平,从而可抑制早期蜕膜细胞的异常凋亡,起到保胎作用。

基于激光解析/离子化-飞行时间质谱技术的中药阿胶蛋白质组分析

目的:应用激光解析/离子化-飞行时间质谱技术对传统中药阿胶蛋白/肽成分进行蛋白质组初步分析,建立阿胶蛋白质质量指纹图。方法:实验于2004-06/2005-03在湖南中医药大学蛋白质组学实验室完成。采用饱和硫酸胺沉淀,透析脱盐冻干法获得阿胶水溶性蛋白/肽,采用Ciphergen BiosystemsInc.ProteinChipRBiology System(美国PBSⅡ+)及配套的NP10芯片、激光解析/离子化-飞行时间质谱技术,分析阿胶Mr1500～13000区间蛋白质、肽分布及其相对分子质量。结果:Mr2000～4000区间显示4个相对分子质量峰,可能是2种肽;Mr4000～5000区间显示8个相对分子质量峰,可能为2种肽;Mr5000～5500区间显示16个相对分子质量峰,约为3种肽;Mr5500￣6200区间无峰;Mr8100～8200区间显示5个相对分子质量峰,可能为1种肽;Mr11200～11400区间显示5个相对分子质量峰,可能为1种蛋白质。不同质量浓度稳定获得的有意义蛋白/肽共计9个。不同相对分子质量肽之间差分别提示可能为丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸残基相对分子质量。结论:通过分析,可以形成阿胶蛋白质/肽成分质量指纹图,可作为阿胶数字化质控标准;并为进一步分离、纯化及验证阿胶功能相关活性蛋白质/肽组分提供可靠信息。

人子宫内膜细胞原代体外培养方法

目的改良人子宫内膜细胞原代体外培养方法的建立,并对其进行特征鉴定。方法将选择的子宫内膜组织机械法分离,复合酶消化,传代自然增殖法纯化细胞,进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态,HE染色观察其胞核情况,免疫细胞化学染色法对间质细胞(endometrial stromal cell,ESC)及上皮细胞(endometrial glandular epithelial cell,EEC)进行鉴定。结果培养的子宫内膜细胞均有ESC和EEC两种形态细胞。EEC和ESC经角蛋白单抗体和波形蛋白单抗体染色,凡是胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。结论成功培养了原代人子宫内膜细胞,方法经济、简单,获得细胞成活率高,生长稳定。成功建立子宫内膜细胞原代体外培养体系,为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。

农村“全托式”幼儿教育访谈及思考

20世纪90年代中期，湖南省浏阳市某农村地区出现“全托式”幼儿教育，这种“全托式”幼儿教育对培养孩子的独立性和生活自理方面有积极作用，而对幼儿社会化行为作用不显著，甚至有消极影响。

滋养层细胞原代体外培养体系的建立

目的 改善体外分离、培养人早孕绒毛细胞滋养层细胞（cytotrophoblast CTB）的方法，并对其进行鉴定，探讨CTB的一些生物学特性。方法 取人工流产6～8周妊娠绒毛，机械法分离，复合酶消化，差速贴壁法纯化细胞后继续培养。倒置显微镜观察其大体形态及体外转化，HE染色观察其胞核情况，免疫细胞化学观察细胞的细胞角蛋白18（cytokeratin CK18）、波形蛋白（vimentin Vim）和人胎盘催乳素（human placental lactogenh PL）的表达。流式细胞仪测定其细胞周期。结果分离培养的CTB呈不规则多角形片状，单层铺展生长。所有的细胞都表达CK18，Vim只在部分细胞表达，hPL免疫反应阳性物质在胞浆表达。细胞周期显示约有58％的细胞处于G0／G1期。结论 成功分离培养了人早孕绒毛CTB，方法简便易行，获得的细胞形态单一、生长稳定，为进一步研究CTB在妊娠生理和妊娠免疫耐受中的作用提供了实验基础。

黄芪丹参复方成分对模型孕鼠滋养细胞基质金属蛋白酶9mRNA表达及白细胞介素-10水平的影响

目的研究黄芪丹参复方成分提高胎盘血供的分子机制。方法提取黄芪、丹参复方成分,运用一氧化氮合酶(NOS)阻滞剂L-精氨酸甲酯(L-NAME)制作一氧化氮合成阻滞大鼠模型,ELISA法检测妊娠18d大鼠血浆白细胞介素-10(IL-10)水平,核酸原位杂交(FISH)法检测胎盘滋养细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA表达。结果模型组IL-10含量较空白组低(P<0.01),治疗组IL-10水平高于模型组(P<0.05);模型组MMP-9mRNA表达增加,明显高于空白组和黄芪丹参治疗组(P<0.01),黄芪丹参治疗组与空白组比较差异无显著意义(P>0.05)。结论黄芪丹参复方成分可能通过干预IL-10与MMP-9的互动关系,影响胎盘滋养层细胞的移行与侵袭性,协调胎盘重构与蜕膜重塑过程,从而阻抑胎盘浅表着床,利于母胎循环构建,维持胎盘血液供应。