基于CRISPR/Cas9技术建立敲除Plac9基因的人胚肾细胞株

目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo2000将表达载体分别转染至293T细胞中,并以流式细胞术对带绿色荧光蛋白标记的细胞进行单细胞分选,分选后的细胞培养一段时间后,用基因组测序和错配酶酶切进行筛选.从筛选好的细胞中提取蛋白,进行WesternBlot检测敲除效率.结果:采用CRISPR/Cas9和流式细胞术结合技术成功构建了Plac9蛋白表达缺失的人胚肾细胞株.结论:该方法简便快捷、效率高,可广泛地用于编辑各种细胞和细胞功能研究.

敲除PLAC8蛋白对人胚肾细胞增殖的影响

为了构建PLAC8蛋白敲除的人胚肾细胞株(293T)并检测其对293T细胞增殖的影响,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术及流式细胞分选术构建敲除PLAC8蛋白的293T细胞株,通过基因组测序及错配酶酶切进行编辑细胞系的筛选。用筛选得到的细胞系提取细胞总蛋白,通过蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测编辑效率。进一步通过细胞生存实验(MTT实验)检测敲除PLAC8对293T细胞增殖的影响,通过蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测敲除PLAC8蛋白后293T细胞中增殖相关基因的表达水平变化。结果表明,成功构建了PLAC8蛋白敲除的细胞系。与野生型细胞系相比,PLAC8表达下调会抑制细胞增殖,且在这一过程中AKT、RAF-1、ERK2、C-MYC等4个与增殖相关基因的蛋白水平改变,提示PLAC8可能通过AKT及RAF-1-ERK2-C-MYC这一级联通路信号调控细胞增殖。

miR-185-5p抑制支气管上皮细胞16HBE增殖的作用机制

目的:研究miR-185-5p抑制支气管上皮细胞16HBE增殖的调控作用及其机制.方法:用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了A549和16HBE细胞内miR-185-5p和PLAC8 mRNA的表达量,用Lipofectamine 3000转染miR-185-5p mimics到16HBE细胞中,用双荧光素酶活性实验检测了miR-185-5p对PLAC8的靶向性.用MTT检测了miR-185-5p对16HBE细胞增殖的影响,用流式细胞术检测了细胞周期分布,用Western blotting检测了细胞内蛋白表达水平.结果:miR-185-5p在正常人肺支气管上皮细胞16HBE中的表达水平低于肺癌细胞A549(P<0.05);将16HBE细胞转染不同浓度的miR-185-5p mimics,16HBE细胞的增殖活性随着miR-185-5p mimics浓度升高而下降(P<0.05).通过生物信息学预测PLAC8可能是miR-185-5p的一个靶基因.16HBE细胞中PLAC8的表达量高于A549(P<0.05).与转染NC对照组比较,转染不同浓度梯度的miR-185-5p mimics到16HBE细胞后48 h,细胞内PLAC8 mRNA含量和蛋白表达量明显降低(P<0.05).双荧光素酶活性结果表明miR-185-5p与PLAC83′UTR结合后抑制其表达.miR-185-5p使细胞周期阻滞在S期,抑制了细胞内c-Myc、CDK2、CyclinA2、P21、p-Cdc2蛋白的表达.结论:miR-185-5p可能通过抑制PLAC8基因表达,抑制16HBE细胞的增殖活性.