海湾扇贝正反交两个家系形态学指标比较分析

以海湾扇贝(Argopecten irradians irradians)正反交两个F1代家系为材料,研究了壳长、壳宽、壳高、全湿质量、软体部质量和壳质量6个生长指标的分布特点。结果表明,各指标两两之间均显著相关,3个质量指标均完全符合正态分布(P>0.05),3个长度指标略偏离正态分布(0.01<P<0.05)。相对于标准正态分布来讲,各形态学指标较小的个体略多。6个性状指标均呈连续分布状态,符合数量遗传学特点。6个指标在正反交后代中差异显著,但均显著高于自交群体。且在反交群体中各指标离散程度较高,初步说明同一扇贝产生雌雄配子时亲本效应不同。

海湾扇贝杂交后代的微卫星鉴定

海湾扇贝(Argopecten irradians)是典型的雌雄同体型贝类,行体外受精,因此杂交育种过程中存在非目标配子污染的问题。本研究筛选10对多态性微卫星引物对海湾扇贝两个亲本及正反交两个F1子代群体各100个个体进行了分析。基因型分析结果表明,所有后代等位基因均来源于双亲,不存在外源等位基因污染情况。卡方检验表明,杂交后代基因型比例符合孟德尔遗传分离比,即微卫星标记符合孟德尔遗传。其中对AIMS026扩增位点的分析结果表明,杂交后代基因型均为双亲互补型,没有出现自交后代基因型,即杂交过程中没有自身配子的污染。该研究证实了微卫星在海湾扇贝中分离的孟德尔遗传规律,同时验证了海湾扇贝杂交过程中一系列避免异源配子污染方法的有效性,为海湾扇贝定向杂交配子隔离的可靠性提供了分子生物学证据。

饥饿和再投喂对中间球海胆代谢和生长的影响

将体质量为(5.72±0.23)g的中间球海胆Strongylocentrotus intermedius分别饥饿0、3、6、9、12 d(分别记为C、S3、S6、S9、S12)后再饱食投喂至30 d,研究了饥饿与再投喂过程中海胆的代谢率、生长率、摄食率、食物转化率的变化。结果表明:在饥饿和再投喂过程中,S3组各指标与对照组无明显差异;S6、S9、S12组在恢复投喂过程中的一段时间内代谢率均维持较低水平,而特定生长率和食物转化率均在恢复投喂初期出现高峰。这说明S6、S9、S12 3个试验组海胆出现了部分补偿生长现象,这种补偿生长是再投喂后海胆通过降低代谢率及提高食物转化率来实现的。

利用AFLP技术分析海扇贝与三种扇贝的亲缘关系

本研究采用AFLP技术,对2005年引自加拿大的海扇贝(Placopecten magellanicus)以及中国北方主要养殖的虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和海湾扇贝(Argopecten irradians)进行了遗传学比较分析。结果表明,共用5对AFLP引物进行了扩增,共扩增出501个位点,多态性位点为392个,多态位点比例为78.24%。平均Nei氏基因多样性指数H分别为0.2139、0.1684、0.1441和0.1670,平均Shannon氏指数I分别为0.3356、0.2681、0.2439和0.2656。海扇贝多态位点比例、Nei氏基因多样性指数和Shannon氏指数均处在较高水平,说明海扇贝遗传多样性较高。UPGMA聚类结果表明,海扇贝与虾夷扇贝亲缘关系最近。

海洋酸化和升温对中间球海胆幼虫发育和生长的影响

为了研究海洋酸化和气候变暖对海洋生物的联合作用,按照文献[4]和[7]中对海洋环境变化的预测趋势,设置了3组海水,即对照组(pH为7.93～7.99,水温T为18℃)、试验组E3(在对照组基础上pH减小0.3,T升高3℃)、试验组E6(在对照组基础上pH减小0.6,T升高6℃),在此条件下对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius幼虫的发育及生长情况进行了研究。结果表明:酸化及升温海水对海胆孵化率没有显著影响;E3组海胆与对照组发育进程一致,而E6组则较慢;E3和E6组海胆分别存活了18 d和12 d,分别发育至八腕幼虫和四腕幼虫阶段,可见试验海水环境严重影响海胆幼虫的存活;E3组海胆幼虫的生长在受精后的前10 d与对照组差异不显著(P>0.05),之后显著低于对照组(P<0.05),而E6组海胆幼虫的生长在整个试验阶段均显著低于对照组(P<0.05);将骨针长度分解为口后腕骨针长度和躯干部骨针长度,各组海胆的生长差异主要表现在口后腕骨针长度上;试验组长腕幼虫畸形均不同程度地表现为腕短小、萎缩、腕骨针折断、骨针弯曲变形等。研究表明,中间球海胆对海洋酸化和气候变暖的海洋环境非常敏感,如果按照预测趋势,海洋环境变化将会对该海胆产生严重的负面影响。

仿刺参体壁创伤修复消减文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH),构建了仿刺参Apostichopus japonicus(体质量为65～90 g)正常体壁及创伤修复(24、48、72、96、120 h后)体壁的消减cDNA文库,利用PCR和斑点杂交技术对文库进行筛选,随机挑取的768个克隆中发现292个阳性克隆,对其中信号强度较强的224个阳性克隆进行测序,得到208个有效EST序列。经BlastX工具对获得的EST与GenBank数据库进行比对分析,结果有171个EST序列与数据库中的基因同源(e≤0.001,相似性>40%),其中153个为未知基因,18个为已知功能或已命名基因,包括在创伤及修复的体壁中上调表达的β微管蛋白、微管蛋白α-1链、肌动蛋白、肌动蛋白ike 7B类似物、细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、tRNA假尿苷合成酶A、GTP酶、细胞分裂周期2类似蛋白、有丝分裂原活化蛋白激酶、homeobox蛋白、延伸因子1A、核糖体蛋白L30、核糖体蛋白L17、60S酸性核糖体蛋白P0、26S蛋白酶调节亚基、泛素特异性肽酶24、大肠癌血清抗原3、清道夫受体蛋白12等。本研究结果可为探讨刺参体壁再生过程和分子机理,以及筛选刺参体壁创伤修复过程中相关功能基因的研究提供基础依据。

饥饿对中间球海胆MYP基因转录表达的影响

应用实时定量PCR技术对主要卵黄蛋白(Major yolk protein,MYP)基因在不同饥饿时期中间球海胆的体腔细胞、性腺、肠、胃中的转录表达差异进行了分析。结果表明,在正常状态下,MYP基因在体腔细胞、性腺、肠、胃等不同组织中的转录表达差异明显,肠中的表达量最高,其他组织中的表达量均较低。随饥饿时间的延长,MYP基因在体腔细胞中的表达量先迅速下降,而后稳定在较低水平,实验结束时下降至对照组的1.58%;在性腺中的表达量持续上升,实验结束时上升至对照组的679.75%;在肠中的表达量持续下降,实验结束时下降至对照组的33.33%;在胃中的表达量呈上升趋势,实验结束时上升至对照组的106.52倍。综合来看,饥饿状况下,中间球海胆肠中的MYP表达量持续下降,但仍是MYP的主要合成部位;性腺中MYP表达量持续上升,致使其MYP表达比重上升;胃、体腔细胞中表达量在饥饿过程中虽有变化,但总表达量很少,对MYP的整体表达影响不大。

中间球海胆群体遗传学研究中AFLP引物数量及样本量的选择

采用10,20,30,40,50,60,70,80共8个样本量梯度,随机选择并逐步增加AFIP引物组合,研究了AFLP标记数量及样本量对中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)群体遗传学指标的影响。结果表明:基因多样性指数(H)、Shannon氏指数(I)和多态位点比例(PP)3个遗传学指标对样本量的敏感程度不同,PP指标受样本量影响较大,样本量≥50个时方稳定,H指标在样本量≥30时稳定下来,而I指标在样本量≥20时即不再出现显著差异。共采用6对A FIP引物对80只海胆进行群体遗传学研究。通过每1对、每2对、每3对、每4对、每5对引物组合分别计算各遗传学指标,发现前二者所得各值之间以及其与对照值(6对引物所得值)之间存在显著差异,而每三对引物组合计算的各指标间不存在显著差异。据此推测,对中间球海胆进行AFLP标记研究中,样本数量最好不少于50个;而若样本量足够大(80个个体),则至少需要3对AFLP引物(或不少于100个标记),方能对海胆群体进行准确的遗传学评价。

仿刺参体壁再生过程中两个核糖体蛋白基因的表达差异

本研究首次从仿刺参(Apostichopus japonicus)体壁中克隆得到核糖体蛋白L30(ribosomal protein L30,RPL30)的c DNA全长序列(Gen Bank:JQ770165),该序列包括56 bp的5′-UTR,162 bp的3′-UTR和339b p的开放阅读框,共编码112个氨基酸;Blast比对分析结果显示该序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与其他物种的同源性均在75%以上;RPL30基因在仿刺参各组织中均有表达,其中肠、体腔细胞、纵肌、体壁中表达量分别为呼吸树的7.24倍(P<0.01)、4.47倍(P<0.01)、3.12倍(P<0.05)、1.35倍(P>0.05);仿刺参体壁再生不同阶段核糖体蛋白基因RPL30和RPL17的表达存在差异,体壁再生第7 d时RPL30基因的表达出现峰值,为对照组的2.13倍(P>0.05),其余天数的相对表达量均低于对照组,其中第1、5、6d的表达量与对照组差异均显著(P<0.05);RPL17基因在再生第2、5d分别出现峰值,分别为对照组的7.47倍和5.60倍(P<0.05),其余各天的表达量与对照组差异不显著(P>0.05)。研究结果表明核糖体蛋白基因除构成核糖体参与蛋白质合成外,还有着各自的核糖体外功能。本研究结果将为进一步研究仿刺参蛋白质合成、再生及多种生理活动的调控机制奠定基础。

抑制性消减杂交技术在水产无脊椎动物中的应用

抑制性消减杂交技术(SSH)是近年来兴起的一种分离、克隆差异基因的新技术。系统阐述了该技术的原理和优缺点,综述了该技术在水产无脊椎动物差异表达基因筛选方面应用的研究进展,并对该领域面临的问题进行剖析。

基于GA-Chebyshev神经网络的一类分数阶微分方程的数值解

针对一类分数阶微分方程求数值解的问题,在切比雪夫神经网络的基础上,提出一种利用遗传算法优化切比雪夫神经网络的新方法,并通过2个算例验证了该方法的可行性和有效性。研究结果表明:与现有数值方法相比,采用改进的切比雪夫神经网络方法计算微分方程的数值解与准确解更为接近,误差较小。研究结论为分数阶微分方程中类似问题的求解提供了新思路。

菲律宾蛤仔EST-SSRs标记开发及不同地理群体遗传多样性

利用13对微卫星引物对大连、莆田、青岛3个地理群体蛤仔遗传多样性进行了检测。结果表明:13个基因座共检测到154个等位基因,每个座位检测到的等位基因数在2—7个之间,平均有效等位基因数为2.7657;3个群体平均观测杂合度分别为0.4387、0.4194、0.2383,平均期望杂合度分别为0.6488、0.6484、0.5526;群体间的遗传多样性差异不显著(P>0.05)。NJ聚类结果显示大连和莆田群体的蛤仔亲缘关系较近,二者与青岛群体关系较远。3个群体均有不同程度的偏离Hardy-Weinberg平衡现象,表明各群体基因频率和基因型频率的稳定性相对较低。本研究所获得的微卫星标记的多态信息含量(PIC)>0.5,说明这些微卫星位点的多样性较高,可为下一步遗传图谱构建研究提供参考。

中国帘蛤目16种经济贝类DNA条形码及分子系统发育的研究

对中国帘蛤目主要经济贝类的分子系统发育进行了研究,应用DNA条形码通用引物扩增了6种中国近海帘蛤目经济贝类共计60个个体的COI基因片段,与GenBank收录的10种帘蛤目贝类50条同源序列进行比对。结果表明:帘蛤目贝类COI基因存在碱基插入和缺失现象,在16个物种中有6个物种存在103个插入和缺失位点,其中杂色蛤仔Ruditapes variegata、裂纹哥特蛤Katelysia hiantina插入和缺失位点均为30个,大竹蛏Solen grandis为27个;碱基的组成出现偏倚现象,A+T含量(64.2%)明显高于G+C含量(35.8%);基于K2P模型的计算,16个物种的种内平均遗传距离为0.010 6,种间平均遗传距离为0.388 4,后者是前者的21.34倍;系统发育树聚类分析表明,COI基因在科、属、种水平上的鉴定及其系统进化关系重构方面与传统的形态学分类一致性较高。研究表明,线粒体COI基因作为帘蛤目贝类DNA条形码在物种鉴定的适用性上提供了一定的依据,同时也为形态分类系统提供了必要补充。

仿刺参EGFR基因的克隆与表达分析

表皮生长因子受体(EGFR)是多种细胞因子的受体,在细胞增殖、迁移及分化中具有重要的作用。应用RACE法首次从仿刺参体腔细胞中克隆出EGFR基因的全长cDNA序列。该cDNA全长3 826 bp,包括821 bp的5'-UTR,281 bp的3'-UTR,开放阅读框2 724 bp,编码907个氨基酸。推导的氨基酸序列55-184aa和365-487aa符合EGFR基因所具有的L1和L2受体结构域,在203-344aa和503-823aa含有EGFR家族特征区域CR1和CR2半胱氨酸富集区,并同为跨膜糖蛋白,在结构上具有一致性。经BlastP与GenBank已知物种氨基酸序列进行同源性比对,仿刺参EGFR基因氨基酸序列与果蝇EGFR相似性为49%,同源性为34%,与斑马鱼EGFR相似性为47%,同源性为34%,与淡水椎实螺EGFR相似性为49%,同源性为31%。据此推断,仿刺参EGFR基因属于EGFR家族成员。利用Real-time PCR技术检测了该基因在仿刺参各组织中的表达,结果显示在肠、呼吸树、表皮、体腔细胞、纵肌中EGFR均有表达,且体腔细胞和表皮表达量较高。结果表明,该基因可能在仿刺参组织发育和再生过程中起到重要的调控作用。

不同倍性泥鳅鳍细胞系的建立及生物学特性分析

采用组织块培养法启动二倍体、三倍体和四倍体泥鳅鳍组织细胞原代培养,采用胰蛋白酶消化法传代,目前二倍体、三倍体和四倍体细胞已经分别传至59代、68代和68代。三种细胞均为成纤维细胞样细胞。鳍组织无菌处理方法是:先用质量浓度为10%的碘伏浸泡15min;后用青霉素和链霉素的混合液(500 IU/mL青霉素,500μg/mL链霉素)浸泡30min;原代培养和早期传代培养所用的培养基为DMEM/F12,添加体积分数为20%的胎牛血清、10 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20 ng/mLI型胰岛素样生长因子(IGF-I)以及10μg/mL硫酸软骨素。30代以后所用培养基为20%FBS-DMEM/F12。细胞培养在25℃、5%CO2培养箱中。在此条件下,二倍体、三倍体和四倍体的倍增时间分别为48.43h、36.01h和41.45h;二倍体、三倍体和四倍体的特征染色体数目分别为50条、75条和100条;测定的二倍体、三倍体和四倍体细胞及核的体积比分别为1︰1.37︰2.37和1︰1.53︰1.97;细胞经液氮冷冻保存60d后,解冻复苏后测定存活率分别为(80.88±1.38)%、(84.48±1.13)%、(81.57±1.28)%。不同倍性的泥鳅细胞系的建立丰富了鱼类细胞系的种类,为揭示多倍体鱼类生长、遗传等机制打下基础。

雌激素对双齿围沙蚕性比、生长和卵母细胞发育的影响

将性未分化的双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis暴露在双酚A和17β-雌二醇两种雌激素下,研究了雌激素对双齿围沙蚕雌雄比例、个体生长、死亡率及卵母细胞发育的影响。结果表明,两种雌激素各浓度下的试验组沙蚕均为雌性。与对照组相比,双酚A浓度为50、100μg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用（P〈0.01）;浓度为10、150μg/L时,对沙蚕的促生长作用显著（P〈0.05）;浓度为200μg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显;沙蚕的死亡率随双酚A浓度的提高而增加。与对照组相比,当17-β雌二醇浓度为1、5、15 mg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用（P〈0.01）;浓度为30 mg/L时,对沙蚕的促生长作用显著（P〈0.05）;浓度为45 mg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显;随着浓度的提高,沙蚕的死亡率明显加大。双酚A浓度为10~150μg/L、17β-雌二醇浓度为1~30 mg/L时,对沙蚕卵母细胞的生长有明显的促进作用（P〈0.01）;而双酚A浓度为200μg/L（P〈0.05）和17β-雌二醇浓度为45 mg/L（P〈0.01）时对卵母细胞的生长有抑制作用。

仿刺参体壁再生形态学和组织学的研究

用手术刀片切掉仿刺参体壁表皮层和结缔组织层,深度至体腔膜。术后将仿刺参放入正常海水中饲养,用肉眼和光学显微镜观察仿刺参体壁再生的外部形态和组织学变化,并通过免疫荧光方法检测小鼠抗人角蛋白19(CK19)的表达。形态学观察表明:术后1 d,伤口呈凹陷状,体腔膜上增生出一薄层乳白色结缔组织;术后7 d伤口表面出现色素;术后11 d凹陷基本变平;术后21 d,伤口处体壁形态与颜色恢复至术前。组织学观察表明:术后1 d,疏松结缔组织直接暴露,创伤面附近有成纤维细胞和胶原纤维聚集;术后3 d,结缔组织外层有上皮细胞聚集;术后4 d,结缔组织间可见一条带状间隙;术后7 d,表皮外层出现角质层;术后11 d,上皮层厚度接近正常组织,但结缔组织较松散;术后21 d,上皮细胞数量、排列以及结缔组织的排列同正常组织。免疫荧光检测结果表明:CK19在正常的仿刺参体壁中表达得比较分散;术后3 d,CK19在创伤面附近集中表达。

中间球海胆饥饿代谢研究

于 2 0 0 2年 4月至 5月测定了饥饿状态下中间球海胆 (Strongylocentrotusintermedius)耗氧率和排氨率的变化情况 ,得出海胆饥饿后耗氧率、排氨率及氧氮比变化曲线 ,并对海胆性腺主要成分进行组织化学分析。结果表明 :随饥饿时间的延长 ,中间球海胆的耗氧率呈“稳定、急速下降、再稳定”的阶段性变化 ,在整个饥饿期间内下降了 4 5 .6 % ;排氨率经短暂稳定后 ,先上升再阶段性下降 ,实验结束时共下降了 32 .33% ;氧氮比则表现出平稳、下降、上升的趋势。组织化学的测定结果是海胆饥饿前后性腺的主要变化成分为蛋白质和糖类 ,综上可认为 ,海胆饥饿后能源物质利用顺序为 :蛋白质 +糖类、蛋白质、蛋白质

文蛤C型凝集素基因(Mm-Lec1)的克隆与表达分析

文蛤（Meretrix meretrix）是我国重要的滩涂养殖贝类,病害严重影响文蛤增养殖业,研究文蛤的免疫机制有助于解决文蛤的病害问题。C型凝集素（C-type lectin）参与先天免疫,在识别病原相关分子模式和激活体液免疫因子等方面发挥重要作用。本研究检索已构建的文蛤全长cDNA文库,经过Blast比对得到了文蛤C型凝集素1（Mm-Lec1）基因的全长cDNA序列。Mm-Lec1序列全长586bp,5和3非翻译区（UTR）的长度分别为21bp和79bp,开放阅读框长度为486bp,编码161个氨基酸,分子量为18.65kD,理论等电点为4.98。预测的氨基酸序列中含有信号肽（Met1-Ser19）、糖识别结构域（CRD）和糖结合位点（QPN）。Mm-Lec1的三级结构是紧凑型,含有β片层结构。同源性分析结果表明,Mm-Lec1与其他物种C型凝集素相似度在20%~32%;邻接法（Neighbor-Joining,NJ）进化树分析结果表明,Mm-Lec1与紫贻贝CTL 6和栉孔扇贝CTL A聚为一支。实时荧光定量分析结果显示,Mm-Lec1在文蛤鳃、肝胰腺、闭壳肌、外套膜、性腺和血细胞中均表达,其中鳃表达量最高,血细胞次之,性腺中表达量最少;在鳗弧菌（Vibrio anguillarum）刺激实验中,6h时Mm-Lec1在血细胞中的表达量最低,48h表达量最高,暗示Mm-Lec1参与文蛤抵御细菌入侵的免疫过程。

重铬酸钾对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性效应

以二倍体和三倍体泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)鳍细胞系(DIMF和TRMF)为实验材料,研究了重铬酸钾对细胞的氧化损伤、微核形成以及金属硫蛋白表达情况的影响,旨在多角度探讨重铬酸钾对细胞系的毒性效应,建立适合监测其污染情况的指标。采用MTT法测定了细胞的半数抑制浓度;使用试剂盒测定了3种主要抗氧化酶活性;吉姆萨染色后观察了细胞微核的变化,并通过实时定量PCR方法测定了金属硫蛋白的表达情况。结果表明,24 h急性毒性实验两种细胞系的半抑制浓度分别为(25.3±1.2)μmol/L、(27.9±0.6)μmol/L,DIMF对重铬酸钾的敏感性要高于TRMF。当重铬酸钾浓度为0~30μmol/L时,二个细胞系的超氧化物歧化酶(SOD)活性随染毒浓度升高而升高。当重铬酸钾浓度为0~20μmol/L时,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性逐渐升高,浓度为30~40μmol/L时,其活力开始下降。两种细胞系的谷胱甘肽S转移酶(GST)活性随重铬酸钾浓度增大逐渐降低。二倍体细胞系氧化酶活性均低于三倍体。微核试验显示,重铬酸钾可引起细胞核损伤,形成微核。当重铬酸钾浓度为40μmol/L时,DIMF、TRMF微核率达到最大,分别为7.33‰和8.00‰,DIMF微核率要低于TRMF。实时定量PCR结果显示,对照组金属硫蛋白(MT)基因表达量很低,但经重铬酸钾胁迫后,MT基因表达量显著升高(P<0.01)。