SARS灭活疫苗对猴体的免疫原性及保护效果观察

观察SARS灭活疫苗对猴体的免疫原性及保护效果 ,为进一步的临床研究奠定基础 .将BJ0 1株SARS病毒感染的Vero细胞的培养液过滤澄清 ,经 β 丙内酯灭活和超滤浓缩 ,然后经凝胶过滤和离子交换层析获得纯化的SARS灭活疫苗 .经HPLC分析其纯度为 97.6 % ,在电子显微镜下可观察到SARS病毒样颗粒 .蛋白质印迹 (westernblotting)分析表明 ,纯化SARS灭活疫苗可与SARS患者恢复期血清起反应 .纯化的SARS灭活疫苗符合有关的质量标准 .用SARS灭活疫苗免疫猴体可产生高效价的中和抗体 ,可阻止SARS病毒在猴体内增殖 ,且对SARS病毒攻击具有保护作用 .在低中和抗体情况下 ,用SARS病毒攻击免疫猴后没有出现感染增强现象 .猴体免疫SARS灭活疫苗后 ,无论正常剂量还是大剂量疫苗免疫 ,均未发现局部和全身副反应 。

登革热的免疫预防与诊治的基础研究

登革热是由登革病毒引起经蚊媒传播的急性传染病。该病传播快,发病率高,是我国南方重要的病毒性传染病。而且登革病毒也是重要的生物战剂,它包括4个血清型,抗原复杂。至今尚无安全有效的防治措施。

非典型肺炎病例标本中新型冠状病毒的分离与鉴定

目的 对非典型肺炎的病原体进行分离鉴定 ,为该病的诊断、预防和治疗提供依据。方法 采用细胞培养和乳鼠接种法 ,从非典型肺炎病例标本中分离致病病原体 ,通过电镜形态学、血清学和动物致病性观察及RT PCR扩增与部分基因序列分析 ,对分离的病原体进行鉴定。结果 成功地从死亡病例尸解的肺组织标本和患者鼻咽拭子标本中采用细胞培养法分离出病原体。通过电镜在病变细胞及其培养上清中观察到大量冠状病毒样颗粒。免疫荧光染色检测非典型肺炎患者血清 ,表明分离的病毒与此次流行的非典型肺炎密切相关。分离的病毒可对乳鼠致病 ,并在发病乳鼠的肺组织标本中通过电镜同样观察到冠状病毒样颗粒。从非典型肺炎病例尸解肺组织、传代发病小鼠肺组织及分离物感染的细胞培养物中 ,通过RT PCR可分别扩增出冠状病毒的cDNA片段 ,测序结果显示其核苷酸序列与已知冠状病毒的同源性在 6 0 %左右。结论 从非典型肺炎病例标本中已成功分离出一种新的冠状病毒 ,它与此次流行的非典型肺炎密切相关 。

非典型肺炎标本感染乳鼠和Vero E6细胞的病理学观察

为查明非典型肺炎的病原体 ,作者以死亡患者肺组织感染KM乳鼠和VeroE6细胞 ,对发病鼠的主要脏器作病理学检查 ,对出现病变的培养细胞作超微结构观察 ,对细胞培养上清液作电镜负染检查。结果发现 ,患者肺组织可致乳鼠发病死亡 ,病变主要表现在肺脏和肝脏 ,在肺组织中检出病毒。在感染的培养细胞中发现大量病毒 ,在细胞培养液中也检出病毒 ,检出的病毒大多呈球形 ,直径 90～12 0nm ,其形态和细胞内分布与冠状病毒相一致 。

新分离的冠状病毒与严重急性呼吸综合征病原关系的研究

目的 确定新分离的冠状病毒与目前流行的严重急性呼吸综合征的病原关系。方法 以用细胞培养法从严重急性呼吸综合征病例标本中分离出的冠状病毒为抗原 ,通过免疫荧光染色及中和试验测定严重急性呼吸综合征患者血清中抗新分离的冠状病毒的抗体 ,分析确定新冠状病毒与严重急性呼吸综合征的病原关系。结果 在临床确诊的 1 1 3份严重急性呼吸综合征患者血清标本中 ,99份检测出有抗新冠状病毒的抗体。 1 0对双份血清检测结果显示 ,后采集的血清抗体效价均比发病初期采集的明显增高 ,最高的升高 1 2 8倍。中和试验结果证明 ,病人血清抗体能够中和新分离的冠状病毒。结论 新分离的冠状病毒与此次流行的严重急性呼吸综合征密切相关 。

我国D2-43病毒株PrM-E基因的重组SFV的制备及生物学鉴定

为构建含PrM E基因的重组SFV病毒 ,将含我国登革 2型病毒PrM E基因的SFV表达载体和辅助载体DNA线性化后 ,进行体外转录 .然后将获得的 2种RNA转录物共转染BHK2 1细胞 ,以RT PCR法证明转染后的细胞培养上清中含有重组SFV .进一步将该重组病毒经蛋白酶激活后可使BHK2 1细胞产生细胞病变 ,并且以间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒所特有的蛋白 .含我国登革 2型病毒PrM E基因的重组SFV的获得 ,为进一步观察该重组病毒的免疫原性奠定了基础 。

SARS病毒抗体间接免疫荧光检测方法的建立

目的 建立快速检测严重急性呼吸综合征 (SARS)患者血清中特异抗体的间接免疫荧光方法 ,为SARS的临床确诊提供参考依据。方法 用本实验室新分离的SARS冠状病毒BJ0 1和GZ0 1株感染Vero E6细胞 ,待 2 5 %细胞出现病变时 ,用胰蛋白酶消化细胞后以 2× 10 7/ml浓度 4 0 μl的细胞滴到 10孔镀膜的玻片上 ,CO2 温箱培养 4h后丙酮固定。利用制备的抗原片通过间接免疫荧光检测了从北京和广州地区采集的 15 4例临床诊断为SARS的患者和 14例非SARS呼吸系统疾病和 10 0份健康人血清。结果 成功地建立了检测SARS冠状病毒抗体的间接免疫荧光染色方法 ,并对 15 4例临床诊断为SARS的患者的血清标本进行检测 ;SARS冠状病毒抗体阳性 14 2例 ,阳性率为 92 3% ,而 14例非SARS呼吸系统疾病患者和 10 0名健康人血清检测均为阴性。结论 本方法具有良好的特异性和灵敏度 。

4株SARS冠状病毒中国分离株3′非编码区的序列测定及分析

分别对 4株SARS冠状病毒中国株基因组 3′非编码区序列进行测定和分析 ,然后应用Blast、DNAstarGeneQuest等软件对中国株的这段序列与其它SARS和非SARS冠状病毒的序列进行比较 .结果显示 ,所测 4株SARS冠状病毒中国分离株的 3′非编码区长度均为 339nt,与其它已测序SARS冠状病毒的相应序列完全一致 .SARS冠状病毒的非编码区含有冠状病毒保守的“伪结”结构 .在距末端 138nt处还存在 1个长约 32nt的Ⅱ型茎 环结构的序列 ,该序列在其它已知人冠状病毒中并不存在 ,而与禽传染性支气管炎病毒和星状病毒中的对应序列高度同源 .

重要呼吸道病毒病原的多重RT-PCR检测

目的建立一种可同时快速检测引起人呼吸道感染的重要病毒病原的检测方法。方法通过对PCR反应条件的优化,建立同时检测甲型流感病毒(IA)、呼吸道合胞病毒(RSV)和SARS冠状病毒(SARS-CoV)的多重RT-PCR方法。结果该法可同时或分别扩增IA258bp、RSV348bp和SARS-CoV438bp的基因片段。检测的敏感性分别为101.7TCID50/ml、10TCID50/ml和101·5TCID50/ml。采用相同的反应体系和条件,分别对其他7种呼吸道病毒(包括乙型流感病毒,副流感病毒2型,柯萨奇病毒B3和B5血清型及腺病毒2、3和7血清型)进行扩增,均未检测出扩增产物。结论此种多重RT-PCR法可在6h内完成,适用于三种重要呼吸道病毒的快速甄别。

我国登革2/4型病毒株Pr-M-E基因的双表达质粒构建及在真核细胞中的共表达

将我国登革 2、4型病毒分离株PrM E基因通过RT PCR以病毒RNA为模板扩增我国登革 2型 4 3株和 4型B5株的PrM E基因 .并分别克隆至pGEM TEasy载体 ,然后亚克隆至双顺反子表达质粒的两个多克隆位点 ,获得同时含有登革 2型 4 3株和 4型B5株PrM E基因的双顺反子重组表达质粒pIDME2 4 .在用该重组质粒转染的BHK2 1细胞中 ,不但可检测到PrM E基因的转录产物 ,而且采用间接免疫荧光法还可观察到针对登革 2型 4型病毒的特异荧光 .研究结果表明 ,重组的双顺反子表达质粒在真核细胞中可共表达登革两个血清型PrM E基因 。

SARS病毒BJ01株空斑测定方法的建立

目的 建立SARS病毒空斑测定方法 ,为SARS病毒生物学研究提供手段。方法 将不同稀释度SARS病毒BJ0 1株分别接种Vero细胞单层 ,然后加营养琼盖。按DullbeccoR的方法计算空斑滴度。结果 SARS病毒BJ0 1株加营养琼盖后 ,3天即可出现空斑 ,形态呈圆形 ,直径 2 .5～ 3mm ,大小均匀。结论 建立的SARS病毒的空斑方法稳定 。

我国登革3型病毒广西80-2株基因组全序列分析

对我国登革 3型病毒 80 2株基因组进行全序列测定 ,为了解其基因组结构与功能的关系提供依据 .根据登革 3型病毒H87株的序列设计并合成引物 ,应用RT PCR和RACE法 ,对 80 2株基因组RNA进行扩增、克隆测序后获得我国登革 3型病毒广西株基因组序列 .该株病毒基因组全长10 696nt ,不含poly(A)尾 ,4种碱基数分别为A :3 4 3 7,C :2 2 15,G :2 773 ,U :2 2 71.包含一个读码框架 ,自 95至 10 2 67位 ,共 10 170个碱基 ,编码 3 3 90个氨基酸 ,5′和 3′非编码区长度分别为 94nt和4 3 2nt.与H 87株比较 ,核苷酸和氨基酸序列同源性均在 99%以上 ,有 2 8个碱基发生改变 ,其中 2 6个碱基突变发生在读码框架内 ,碱基转换 18个 ,颠换 10个 ;碱基突变引起 14个氨基酸的改变 .80 2株与H87株病毒的基因组全序列同源性高 ,变异度小 .

日本脑炎病毒非结构蛋白NS5对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用

目的探讨日本脑炎病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白,为阐明日本脑炎病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制奠定基础。方法分别构建日本脑炎病毒编码的7种非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)的重组真核表达载体。采用间接免疫荧光法和Western blotting观察它们在细胞内的表达及定位情况。利用含萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,观察表达病毒不同非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的活化程度。构建融合表达红色荧光蛋白的STAT1重组真核表达载体pRed-STAT1,利用该重组载体在表达病毒非结构蛋白的细胞内观察融合蛋白Red-STAT1在IFN-α作用下的细胞内定位情况。同时,对表达病毒非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的STAT1分子的磷酸化水平进行检测。结果日本脑炎病毒的7种非结构蛋白均可在哺乳动物细胞内正确表达,而且表达蛋白均位于细胞质中。在这7种非结构蛋白中,NS5可阻断STAT1分子的核转运及抑制STAT1分子的磷酸化水平,从而抑制IFN-α介导的细胞内JAK-STAT信号转导通路的活化。结论日本脑炎病毒的非结构蛋白NS5对Ⅰ型IFN系统的信号转导通路具有显著的抑制作用,可能是一种Ⅰ型IFN系统的拮抗蛋白。

黄热病毒的一步RT-PCR法检测

自不同稀释度的乳鼠脑病毒悬液中制备总RNA,在自制缓冲液条件下,进行一步RT-PCR法检测.对一步RT-PCR法与常规RT-PCR的敏感性进行比较,并且以基孔肯亚病毒和登革1-4型病毒RNA为模板进行特异性观察.结果表明,本研究建立的一步RT-PCR法可检出2.8×103PFU的病毒,敏感性比常规RT-PCR法高10倍,且与基孔肯亚病毒、登革病毒1-4型无交叉反应,具有良好的特异性和敏感性,适用于黄热病毒的病原学检测.

我国3株登革2型病毒E基因序列测定及毒力基因位点分析

目的 测定我国 3株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革 2型病毒流行株E基因序列并找到可能与毒力相关的基因位点。方法 运用RT -PCR法测定我国 3株登革病毒的E基因序列。结果 DEN2 - 0 4、43、44株的核苷酸及氨基酸同源性均在 95 %以上 ,DEN2 - 0 4与DEN2 - 43、44共有 4个氨基酸差异引起极性或电荷的变化。结论 E6 4、E2 0

三种中药处方对SARS相关冠状病毒体外抑制作用的初步研究

探讨三种中药处方对Vero-E6细胞内SARS相关冠状病毒的抑制作用。取一定量的SARS相关冠状病毒BJ01株加入培养好的Vero-E6细胞中,置37℃、5%CO2孵箱吸附2h,吸出病毒液,再分别加入不同浓度的药物稀释液,在同样条件下培养48～72h,观察细胞病变情况。迪康注射液、连花清瘟胶囊和复方连蒲颗粒抑制Vero-E6细胞内SARS-CoV的半数有效浓度EC50分别为0.056、0.11和0.49mg/ml,治疗指数TI分别为53.6、40.3和4.0。说明上述三种中药处方在体外对SARS-CoV有一定抑制作用,

SARS动物模型的研究

利用分离的SARS CoV毒株BJ 0 1,经滴鼻等途径感染大鼠、豚鼠、黑线仓鼠、白化仓鼠和雏鸡等 5个种属的动物 ,筛选对SARS易感的小动物。在此基础上 ,选择食蟹猴和恒河猴进行SARS的人工感染实验 ,评价其作为SARS动物模型的可能性。结果表明 ,大鼠、豚鼠、黑线仓鼠、白化仓鼠和雏鸡等动物对SARS均不易感 ,感染后未观察到任何的临床及病理学改变 ,不过从感染 2周后的大鼠和豚鼠的肺和咽等组织样本中检测到了的特异的核酸 ,提示SARS CoV能够在这两种动物的体内复制。从感染猴子的分泌物和脏器中分离出了病毒 ,证明SARS CoV也能够在猴子体内复制。临床和病理组织学检查结果显示 ,SARS病毒接种食蟹猴和恒河猴后 ,可以引起所有实验猴发生间质性肺炎 ,其病理学改变与人类感染SARS病毒后肺部病变近似 ,但病变的严重程度比较人类的轻得多 ,除此之外无任何其它的明显的临床表现及组织病理学改变 ,按照动物模型的指标判断食蟹猴和恒河猴并不是SARS的理想动物模型 ,不过在目前尚没有更理想的动物模型情况下 ,以间质性肺炎为病理学检查指标 。

细胞密度和感染复数对SARS病毒在Vero细胞中增殖的影响

阐明宿主细胞密度和病毒感染复数(MOI)对SARS冠状病毒增殖的影响,为SARS灭活疫苗的研究奠定基础。采用析因设计方法,考虑MOI(0.01、0.05和0.1)与细胞密度(2×104、4×104和8×104/cm2)2个3水平实验因素,在各水平组合条件下培养SARS病毒,以组织培养半数感染量(TCID50)作为观测指标,分析SARS冠状病毒滴度在不同增殖条件下的差异。结果表明,MOI、宿主细胞密度和二者之间的交互作用对SARS病毒滴度的影响分别具有非常显著性差异(F=12.70,P<0.01)、显著性差异(F=6.94,P<0.05)和非常显著性差异(F=8.22,P<0.01)。在0.01MOI和8×104/cm2条件下,病毒滴度达5.57×105TCID50/mL。说明SARS冠状病毒在培养细胞中的增殖能力显著依赖于宿主细胞密度、病毒感染复数和二者的交互作用。

我国登革 4型病毒 B5株基因组全序列的测定及分析(英文)

对我国登革 4型病毒 B5株 (D4- B5)基因组进行全序列测定及分析 ,为研究病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革疫苗奠定基础 .根据登革 4型病毒 81 4669株的序列设计特异引物 ,通过 RT- PCR扩增出 D4- B5株不同长度的片段 ,分别克隆到 p GEM- T载体 ,将挑取的阳性克隆进行 PCR、酶切鉴定及序列测定 .结果显示 ,D4- B5株的基因组全长 1 0 665nt,5′和 3′非编码区分别为 1 0 1 nt和 40 3nt,中间一个长 1 0 1 61 nt的开放读码框架 ,编码 3387个氨基酸 .与 D4- 81 4669株比较 ,两者核苷酸序列同源性为 93.0 8% ,氨基酸序列同源性为 96.58% .D4- B5株的基因组全序列与 D4- 81 4669株类似 ,但也有较大差异 .同源进化分析表明 ,D4- B5株的基因型为 型 ,与登革 4型病毒菲律宾分离株亲缘关系较近 .这是首次报道的我国登革 4型病毒分离株基因组全序列 ,对研究病毒基因组结构与功能的关系 ,探讨我国毒株的地理来源及研制适合我国人群的新型登革疫苗具有一定的意义 .

我国两株登革2型病毒5′和3′端非编码区序列测定及二级结构分析

为测定我国两株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革 2型病毒流行株 5′和 3′端非编码区序列 (untranslated region,UTR) ,分析二级结构差异与毒力变化的关系 ,分别从 D2 - 0 4、D2 - 44株感染的 C6/ 36细胞及鼠脑中提取总 RNA.以该 RNA为模板 ,利用 RACE法 ,分别扩增了 D2 - 0 4、D2 -44株的 5′和 3′末端 c DNA片段 .将其分别与 p GEM- T载体连接得到重组质粒 ,测定上述 c DNA插入片段的序列 .用 RNAdraw软件预测 D2 - 0 4、D2 - 44株 5′和 3′端非编码区的二级结构 .D2 - 0 4、D2 -44株 5′端和 3′端非编码区分别有 96和 454个核苷酸 .其中 5′非编码区 59位 C(D2 - 0 4 )→T(D2 -44 ) ,使 D2 - 44二级结构稳定性下降 ;3′端非编码区有 1 5个核苷酸不同 ,其中 T(355)→ A,T(32 6)→ G引起了所在位置二级结构自由能变化 ,且分别位于两个保守序列区 (conserved sequence,CS)CS1、CS2 A.这些位点变化可能与毒力有关 .