植物细胞培养法商品生产有用物质的若干问题探讨

生物技术是我国十分重视的高技术之一,植物细胞大量培养生产有用物质是植物生物技术的重要研究领域之一。如何加快该技术的商品化生产进程是一个广为关注的问题。本文对植物细胞大量培养进行工业化生产的研究现状、生产可行性分析、存在问题及研究动向进行初步探讨,以期对我国的研究有所裨益。

蝙蝠蛾拟青霉与冬虫夏草关系的分子系统学研究

以5月和6月两个不同时段采集的分别产于青海省化隆县和四川省康定县的冬虫夏草(Cordycepssinensis)新鲜子实体为材料,采用分子生物学方法,以rDNA-ITS序列为分子标记,对蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)与冬虫夏草之间的关系进行了探讨。以真菌通用引物ITS1/ITS4分别对蝙蝠蛾拟青霉及冬虫夏草子座和僵虫基因组DNA进行PCR扩增,获得的片段克隆到pMD18-TVector上进行测序,结果表明,随机挑取的46个克隆与某些已在GenBank中注册的中国被毛孢(Hirsutella sinensis)或冬虫夏草的rDNA-ITS序列的一致性均在99%以上,但与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列的一致性约为72%。根据蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列设计了两对特异引物,分别以不同产地及不同生长时期共4个批次的冬虫夏草子座和僵虫基因组DNA为模板,进行PCR及巢式PCR扩增,均得到了相应片段,该片段与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列具有100%的一致性。在GenBank中注册号为AB067740的另一个标明为冬虫夏草的rDNA-ITS序列与注册号为AJ309353的中国被毛孢的rDNA-ITS序列一致性仅为87.3%,但根据AB067740序列设计特异引物,也从冬虫夏草基因组DNA中扩增到其相应序列。研究结果表明,在天然冬虫夏草中除了中国被毛孢之外,还普遍存在着蝙蝠蛾拟青霉等内寄生菌。

何首乌毛状根培养及其活性成分的产生

利用发根农杆菌LBA940 2诱导药用植物何首乌产生毛状根。PCR扩增和Southern印迹杂交实验证实发根农杆菌中Ri质粒的T DNA片段已整合进入植物核基因组中。经过基本培养基的筛选和毛状根生长动力学的考察 ,确立了何首乌毛状根在MS培养基中的最佳继代时间为 30d左右。HPLC实验测定结果显示 ,毛状根培养物中大黄酸的含量是原植物的 2

温郁金和川郁金的PAPD研究

目的：探讨用ＰＡＰＤ技术解决Ｃｕｒｃｕｍａ属植物和药物分类存在的问题和争议。方法：对温郁金Ｃ．ｗｅｎｙｕｊｉｎ和川郁金Ｃ．ｓｉｃｈｕａｎｅｎｓｉｓ进行了ＰＡＰＤ研究。结果：２种亲缘关系很近，聚类结果表明难以从ＤＮＡ水平上把二者划分为２个种。结论：结合化学和形态资料，我们认为２种应予以合并，学名应用Ｃ．ｗｅｎｙｕｊｉｎ，但温郁金和川郁金经长期栽培，化学品质有一些区别，可分为２个药材品种。同时也指出了用花葶中央出和侧生作为分类依据值得商榷。此外，还证明温郁金与毛郁金Ｃ．

代谢工程酵母菌合成紫杉烯的研究

紫杉烯是紫杉醇生物合成的重要中间体,为在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中建立一个生物合成紫杉烯的代谢途径,克隆了酵母的羟甲基戊二酰CoA(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A,HMG-CoA)还原酶基因和=牛儿基=牛儿基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate,GGDP)合酶基因,并构建了其融合表达载体pGBT9/HG;同时构建了包含紫杉烯合酶基因的表达载体pADH/TS;将这两个表达载体共转化酵母细胞,通过GC-MS分析检测工程酵母的代谢产物,结果表明获得的工程酵母能够合成紫杉烯,即在酵母细胞中建立了一个合成紫杉烯的代谢途径。

磷酸二酯酶4研究进展

环腺苷酸(cAMP)和环鸟苷酸(cGMP)对于细胞的许多功能有重要作用。磷酸二酯酶(PDEs)催化cAMP和cGMP水解开环分别生成AMP和GMP,这是细胞内降解cAMP和cGMP的唯一途径。PDEs可分为11个家族,其中有8个家族可以水解cAMP,包括能专一性地水解cAMP的PDE家族(如PDE4),和既可水解cAMP又可水解cGMP的PDE家族。PDE4同工酶主要存于在炎症细胞中。PDE4可分为A、B、C、D 4个亚家族,根据其N端的特殊结构,有长、短和超短三种形式。PDE4催化区三维结构的阐明有助于它们功能的研究和相关药物的设计。PDE4通过与其它蛋白如抑制蛋白、A激-酶锚定蛋白(AKAP)以及活化的C激酶1受体(RACK1)等相互作用使cAMP浓度区域化,选择性地调节各种细胞功能。PDE4作为一个治疗靶点,研究其选择性抑制剂具有重要的意义,可以用于治疗由炎症引起的疾病,如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、阿尔采末病(AD)、帕金森病(PD)和中风等由潜在的炎症引起神经元受损造成的中枢神经系统疾病。

紫杉醇生物合成的研究进展

紫杉醇是一种抗癌新药。紫杉醇及其衍生物还具有防治移植动脉硬化、抗瘢痕形成和抗血管生成等功能。目前,人们获得紫杉醇的方法主要有以下几种:直接从红豆杉中提取;化学全合成;化学半合成;细胞培养;内生真菌提取培养及代谢工程生产紫杉醇。已从红豆杉中克隆出了至少14个和紫杉醇生物合成相关的基因并进行了功能鉴定。紫杉醇生物合成途径的阐明带动了紫杉醇前体组合表达系统的研究。

HMG-CoA还原酶和FPP合酶基因拷贝数对紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌产量的影响

从青蒿中克隆了紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS),从酿酒酵母中克隆了HMG-CoA还原酶(HMGR)催化结构域和FPP合酶(FPPS)基因。构建含ADS基因的酿酒酵母表达载体pYeDP60/G/AS,将其转入酿酒酵母,获得能产生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌,以朱栾倍半萜为参照,产量为10μg.L-1。另外构建了含HMGR和FPPS基因的酵母表达载体pGBT9/A/HMG/G/FPP,将该载体和pYeDP60/G/AS共转入酿酒酵母,得到第二个能产生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌,产量为23.6 mg.L-1,结果表明增加HMG-CoA还原酶和FPP合酶基因的拷贝数能显著增加酵母工程菌的紫穗槐-4,11-二烯产量。

何首乌毛状根的诱导及其培养

利用发根农杆菌LBA940 2和R16 0 1诱导药用植物何首乌产生毛状根。由PCR扩增和Southern杂交证实 ,由LBA940 2诱导的毛状根整合了Ri质粒的TL DNA片段 ;冠瘿碱的高压纸电泳证实 ,由两种菌诱导的毛状根整合了Ri质粒的TR DNA片段。毛状根经抗生素和温度除菌后 ,表现出粗壮、绒毛密集、分枝多 ,且在无激素的培养基上能够快速稳定繁殖的特性。经筛选得到何首乌毛状根优良离体培养系PC9e和PC1e。

丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备

用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhizacopalyl diphosphate synthase,SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达;对影响可溶性表达的4个因素,即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A600)和诱导时间进行了优化。结果发现在宿主菌A600达到1.0时加入0.4 mmol.L-1IPTG,在20℃诱导培养8 h表达的可溶性蛋白量最高,约占细胞总蛋白的35.6%。用Ni2+亲和色谱法纯化表达产物,纯化蛋白产率达到12.3 mg.L-1。将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清,ELISA测定效价为1∶24 300,且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原,获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体,为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础。

中国红豆杉细胞色素P450还原酶的基因克隆、表达与活性分析

细胞色素P450还原酶(Cytochrome P450 reductase,CPR)是细胞色素P450羟基化酶电子传递链的组成部分,在生物体内起着重要的电子传递作用。文章从中国红豆杉(Taxuswallichiana var. Chinensis)愈伤组织细胞中克隆CPR基因(TchCPR),TchCPR含有一个2154bp碱基的阅读框,编码717个氨基酸残基;在氨基酸水平上它与裸子植物细胞色素P450还原酶的同源性(>82%)高于其他被子植物的细胞色素P450还原酶(<74%)。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达了全长和从N-端截短不同数目氨基酸残基的6个融合肽段,经亲和层析纯化,分析了表达的不同长度融合蛋白的电子传递效率。结果表明截短长度大于61个氨基酸残基肽段的胞色素P450还原酶都能够诱导表达,在表达水平上无显著差异,而截短61个氨基酸的CPR融合蛋白电子传递的催化活性(1.6057nmol Cyt Cred/min/μg TchCPR融合蛋白)高于其他4个融合蛋白。

青蒿P450 cDNA基因的克隆及生物信息学分析

目的:对青蒿P450 cDNA基因进行克隆和生物信息学分析。方法:通过RT-PCR,从青蒿cDNA中克隆了1个P450基因;通过生物信息学方法,对其结构特点进行分析。结果:该P450 cDNA基因ORF为1 464 bp,编码488个氨基酸,该序列在GenBank上的登录号为DQ667171。编码蛋白是一个中等大小的A型P450,相对分子质量54.992 kDa;等电点8.83,定位于线粒体,和CYP71AV1具有很高的同源性。结论:该青蒿P450和CYP71AV1在进化和性质上很接近,可能在青蒿中执行类似功能。

唐古特山莨菪毛状根对去氢表雄酮的生物转化

目的 通过生物转化对去氢表雄酮进行结构修饰 ,以期获得更有意义的转化产物。方法 利用唐古特山莨菪毛状根液体悬浮培养体系对去氢表雄酮进行生物转化 ,通过柱色谱及制备薄层色谱进行分离纯化 ,利用核磁共振、ESI MS等光谱鉴定结构。结果 分离得到了 5个转化产物 ,即 :androst 4 ene 3,1 7 dione (I) ;6α hydroxyandrost 4 ene 3,1 7 dione (II) ;6α ,1 7β dihydroxyandrost 4 ene 3 one(III) ;androst 4 ene 3,6 ,1 7 trione (IV) ;1 7β hydroxyandrost 4 ene 3 one (V)。结论 所得到的

大肠杆菌组合生物合成紫杉烯的研究

目的在大肠杆菌中建立一个能够生物合成紫杉烯(紫杉醇生物合成的第一个重要中间体)的代谢途径。方法利用PCR方法克隆编码大肠杆菌1-脱氧-5-磷酸木酮糖(D-1-deoxyxylulose 5-phosphate,DXP)合酶和异戊烯二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)的基因,以及编码辣椒(Capsicum annuum)牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate,GGDP) 合酶的基因。分别构建含DXP合酶基因的表达载体pSLB208/DXP和含GGDP合酶与IDI异构酶基因的融合表达载体pAIG。将含紫杉烯合酶的表达载体pETB3和本研究构建的这2个表达栽体共转化大肠杆菌,诱导4个基因在大肠杆菌中共表达;并通过GC-MS分析大肠杆菌工程菌的代谢产物。结果在大肠杆菌中构建了一个合成紫杉烯的途径,通过GC-MS分析检测到紫杉烯的合成。结论利用代谢途径工程合成紫杉醇中间体是可行的,可为其他萜类化合物中间体代谢工程研究提供坚实的物质基础。

唐古特山莨菪毛状根中东莨菪碱产生的研究

以唐古特山莨菪的无菌苗叶为外植体 ,通过发根农杆菌诱导获得了唐古特山莨菪的毛状根培养系统 ,应用PCR方法鉴定了转化毛状根 ,并应用薄层扫描方法对唐古特山莨菪毛状根生物碱进行了测定 ,结果表明 :在液体培养毛状根的培养基中东莨菪碱含量可达 10mg/L 。

SARS冠状病毒未知功能小蛋白大肠杆菌表达及条件优化

将人工合成的SARS-CoV三个未知功能小蛋白X4、X5和ORF10的编码基因克隆到载体pET32a中,构建其表达载体。再将这些表达载体转入大肠杆菌中进行表达,SDS-PAGE和Western blotting结果证明,X4、X5和ORF10三个基因在大肠杆菌中均获得表达。分别研究了温度、IPTG浓度、IPTG加入时间和诱导时间对重组蛋白表达的影响。通过正交分析,得到了上述三种重组蛋白的优化表达条件。根据最佳条件表达重组蛋白,获得重组蛋白占总蛋白的百分比分别是:X4,20%;X5,27.8%;ORF10,68.5%。

药用植物功能基因

药用植物功能基因研究是药用植物基因研究中最活跃的领域。以药用植物功能基因在GenBank中注册的统计数据为基础 ,介绍了药用植物功能基因研究的最新进展。注册的功能基因涉及 32属 42种药用植物。统计数据包括 :自 1 992年至 2 0 0 3年 (前 9个月 )每年注册基因总数、基因注册数最多的 1 6种主要的药用植物以及在药用植物功能基因研究方面比较活跃的 1 4个国家。还重点报道了植物功能基因专利注册情况、黄酮类化合物与紫杉醇生物合成基因研究进展以及植物P45 0基因研究现状 ,对药用植物生物合成功能基因研究的发展趋势进行了探讨。

β-木糖苷酶的研究进展

综述了β-木糖苷酶的性质、结构、催化机制和基因工程等方面的研究进展,并展望了该研究在能源工业、造纸工业和医药工业上的应用前景。

植物细胞色素P450基因的异源表达系统研究进展

细胞色素P45 0氧化酶是一类具有多种催化功能含血红素的氧化酶系。由于参与多种类型的氧化反应 ,在植物生命活动中有重要功能 ,其研究一直受到重视。自 1 990年第一个植物P45 0基因成功克隆以来 ,到 2 0 0 2年年底 ,已有 60 0多个P45 0基因被克隆 ,有 1 0 0多个基因在细菌、酵母、杆状病毒昆虫细胞等异源表达系统中成功表达并鉴定了功能。拟对植物P45 0的大肠杆菌、酵母、杆状病毒昆虫细胞表达系统的特点进行比较 ,对在各表达系统中成功表达并进行了功能鉴定的植物P45 0进行归纳 ,并对目前植物P45 0异源表达的现状和应用进行概述。

青蒿素生物合成研究进展

目的介绍青蒿素生物合成的研究进展。方法以近几年有代表性的文献资料为依据,结合本实验室的工作,进行归纳,总结和分析。结果与结论青蒿素是一种具有独特结构的新型抗疟药,药物需求很大。近年来青蒿素生物合成研究进展迅速。青蒿素前体青蒿酸生物合成途径已基本明确,参与青蒿酸生物合成的酶基因都已经被克隆并进行了功能鉴定。将青蒿素生物合成相关基因导入微生物,利用微生物生产青蒿素前体物质青蒿酸的代谢工程取得了突破性的进展。但也有实验表明,在青蒿中可能存在两条青蒿素生物合成途径。