山东五大地方鸡禽白血病病毒主要流行亚型鉴定及其分离株gp85基因的分子特征分析

通过对山东五大地方鸡(寿光鸡、芦花鸡、百日鸡、琅琊鸡、鲁西斗鸡)不同亚型禽白血病病毒(ALV)分离株鉴定及gp85基因序列分析,探究山东五大地方鸡ALV的主要流行亚型及gp85基因分子特征。分别将寿光鸡、百日鸡、芦花鸡的无菌抗凝血和琅琊鸡、鲁西斗鸡的卵白接种CEF培养9~10d,常规方法提取感染细胞的cDNA,用针对J亚型ALV(ALV-J)gp85基因(924bp)的引物和A^J(含囊膜蛋白env基因,2 400bp)的群引物进行PCR扩增、克隆、测序并分析其特点。本研究发现,2009—2011年间,山东五大地方鸡均存在ALV-J感染,5个ALV-J分离株gp85基因之间的相似性为98.4%~99.9%,与原型毒株HPRS-103相似性为97.8%~98.3%;均扩出内源性ALV(ALV-E)片段,与不能产生传染性病毒粒子的ev-1、ev-3、ev-6毒株相似性最高,推测为鸡基因组所携带;同时还发现,琅琊鸡、芦花鸡存在A亚型ALV(ALV-A)的感染。研究结果表明,2009—2011年间的山东五大地方鸡已经普遍存在ALV-J,两大品系中存在ALV-A和ALV-J共感染,同时ALV-E的片段广泛存在,这一结论揭示出山东地方鸡的禽白血病净化工作更加具有挑战性。

大黄体外抗猪流行性腹泻病毒的研究

为研究大黄对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染所引起的细胞病变的抑制作用及其机理,本试验采用形态学观察法测定大黄溶液在Vero细胞上的最大安全浓度,建立体外病毒感染Vero细胞模型并利用该模型进行了大黄对病毒抑制作用的研究。结果显示,本试验成功建立了体外病毒感染模型和大黄的抗病毒试验方法;大黄在Vero细胞上的最大安全浓度为3.28mg/mL;形态学观察法和MTT法均显示大黄不仅能阻断病毒吸附Vero细胞,抑制病毒的合成复制,还可直接灭活病毒。本研究结果表明,大黄具有抗PEDV的作用,为临床上预防和治疗猪流行性腹泻(PED)提供理论基础。

PCR检测血液样品方法在禽白血病净化中的应用研究

本研究选择山东某地方品种祖代种公鸡的177份血液样品和177份泄殖腔棉拭子样品为试验材料,应用ELISA、病毒分离、PCR等方法对禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27抗原进行检测。结果显示,血清、泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原阳性率分别为20.34%(36/177)、26.55%(47/177);病毒分离率为1.70%(3/177),血液样品PCR方法检出J亚群ALV(ALV-J)阳性率为0.56%(1/177),序列分析结果显示为ALV-J,但该血液样品的病毒分离结果为阴性。研究表明,PCR检测血液样品方法的应用有助于减少禽白血病净化所需的病毒分离结果的可能缺漏。在此基础上,优化并进一步拓展对其他亚群ALV的PCR方法检测,可作为禽白血病经典净化方法的有力补充,并加快我国地方品种鸡禽白血病的净化进程。

中草药和益生菌复方制剂对肉鸡法氏囊生长发育的影响

旨在研究中草药和益生菌复方制剂对肉鸡体重、法氏囊指数、法氏囊组织结构及淋巴细胞增殖活性的影响。选用5日龄健康AA肉仔鸡120只,随机分3组,对照组自由饮水,试验组分别添加0.1%和0.2%的中草药(黄芪、淫羊藿、党参)和益生菌复方制剂,试验期为3周。结果显示,各处理组肉鸡的法氏囊指数均明显高于对照,14日龄,0.1%和0.2%添加组法氏囊指数分别比对照高出41.96%和34.97%,差异极显著(P<0.01);各处理组肉鸡的法氏囊皱裂较发达,淋巴小结排列紧密且规则,淋巴细胞数量较多;淋巴细胞增殖试验显示,20日龄时,各试验组肉鸡的法氏囊淋巴细胞增殖活力极显著高于对照(P<0.01)。结果表明中草药和益生菌复方制剂能够显著促进肉鸡法氏囊的发育,增强机体的免疫功能。

DF1细胞替代DF1细胞上清快速检测外源性禽白血病病毒的探究

本研究旨在探究用DF1细胞替代DF1细胞上清对外源性禽白血病病毒(ALV)进行快速检测。采集ALVp27抗原阳性的地方品种百日鸡的抗凝血22份,阴性鸡的抗凝血2份,离心取白细胞接种DF1细胞培养,重复9块24孔细胞培养板。每隔24h取1块24孔板,分别收集细胞上清与DF1细胞于-20℃冻存,直至第9天,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测所有细胞上清与DF1细胞中的ALVp27抗原,并采用SPSS Statistics 17.0软件比较分析细胞上清与DF1细胞中ALVp27抗原S/P值的差异性与相关性。结果显示:培养8d的细胞上清中可检测到所有的15份阳性样品,而培养4d即可在DF1细胞中检出所有阳性样品(15份);15份外源性ALV样品在细胞上清中初始检出p27抗原阳性时,同一培养时间的DF1细胞中的S/P值均明显高于细胞上清中的S/P值,差异极显著(P<0.01);培养4～5d的DF1细胞与第9天收集的细胞上清中p27抗原S/P值相关性最高,分别为0.946、0.923。本研究显示,检测培养4～5d的DF1细胞中的ALVp27抗原与经典方法所要求的检测培养9d的细胞上清中的ALVp27抗原可达到相同的效果。

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的克隆表达及其生物学特性的初步研究

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的生物学特性,根据Gen Bank上登录的PRRSV的基因序列设计引物,以生物研究院保存的PRRSV病料的总RNA为模板进行RT-PCR,获得N基因的完整开放阅读框为372bp,构建原核表达载体p ET-28a-N并转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达得到重组蛋白包涵体,经破碎、纯化、透析复性后通过SDS-PAGE电泳检测和Western blot分析表达产物的特性。结果显示,获得的重组蛋白大小约为21KD,能与抗PRRSV N蛋白的多抗发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的免疫原性。BCA法测定蛋白浓度为540μg/m L,说明蛋白表达量较高。因此,试验重组蛋白表达量较高,且具有良好的免疫原性。

马立克疫苗的质量检测及其对鸡源食品安全的影响分析

山东某种鸡场7个父母代鸡群应用2个批次马立克（MD）CVI988/Rispens疫苗免疫后仍发生疑似MD病。本研究对其送检的3瓶MD苗（2个批次，编号为F11、F21、F22，其中F21、F22为同一批次）进行了毒力测定及禽白血病病毒（ALV）的检测。结果显示：MD疫苗F11、F21、F22的毒力检测结果分别为800PFU/羽份、1300PFU/羽份、1480PFU/羽份，3瓶疫苗的毒力均低于国家兽医药典规定2000PFU/羽份的标准，F11低于OIE规定不少于1000PFU/羽份的标准；3瓶MD疫苗冻融后上清和细胞培养上清的p27抗原均为阳性；3瓶疫苗均检测出E亚型ALV（ALV-E）的囊膜蛋白（env）基因（PCR方法扩增2400bp片段，包括LTR序列），与经典ALV-E株RAV-0（E）、SD0501（E）的同源性为98.9%-99.4%。本研究发现，送检的3瓶2个批次MD疫苗存在毒力不足和内源ALV污染的质量问题，有可能是该种鸡群发生疑似MD病的原因之一。