两种代谢法荧光标记牙龈卟啉单胞菌及其在活体成像中的效果比较

目的探讨两种代谢法荧光探针对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)的影响,并比较两种荧光探针标记的Pg在小动物活体成像中的应用效果。方法本研究通过单位伦理委员会审查及单位实验生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准。Pg通过生物正交反应整合四酰化N-叠氮基乙酰半乳糖胺(N-azidoacetylgalactosamine,Ac4GalNAz),再通过点击化学反应实现了Cy5-二苯并环辛炔(Cy5-Dibenzocyclooctyne,Cy5-DBCO)、Cy7-DBCO标记。根据细菌不同标记状态进行分组:Pg组(对照,未经荧光标记的Pg)、Cy5-Pg组(Cy5-DBCO标记的Pg)、Cy7-Pg组(Cy7-DBCO标记的Pg)。细菌活死染色试剂盒检测Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg的活性;Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg分别刺激人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)后检测HGF白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8的mRNA水平和HGF增殖能力;与大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)共培养检测荧光标记的Pg的稳定性;用小动物活体成像系统(in vivo imaging system,IVIS)检测系列浓度梯度的Cy5-Pg、Cy7-Pg的荧光强度。最后,将Cy5-Pg、Cy7-Pg分别经口灌饲给C57BL/6J小鼠,IVIS分别检测Cy5或Cy7信号强度,计算信噪比。结果代谢法可以被应用于活的Pg的荧光标记,Cy5、Cy7标记Pg的最佳浓度分别为20μmol/L、30μmol/L。Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg中活死细菌所占面积比值分别为1.86、1.85、1.88(F=0.318,P>0.05)。Cy5-Pg、Cy7-Pg、Pg刺激HGF 6 h后,HGF的IL-6、IL-8 mRNA水平分别比Ctrl组(无细菌刺激组)升高了7.86、7.46、6.56倍(IL-6,F=40.886,P<0.001)和12.43、13.03、13.71倍(IL-8,F=18.781,P<0.01),3个实验组间无明显差异(P>0.05)。Cy5-Pg、Cy7-Pg、Pg以不同MOI(multiplicity of infection)刺激HGF,与Ctrl组(无细菌刺激组)相比,HGF的增殖能力均显著下降(MOI=10~4∶1,F=153.52,P<0.001;MOI=10~5∶1,F=331.21,P<0.001;MOI=10~6∶1,F=533.65,P<0.001),3个实验组间差异无统计学意义(P>0.05)。Cy5-Pg或Cy7-Pg与E.coli共培养的24 h内,仅有非常少的E.coli被标记上荧光,且3 h内荧光强度几乎无衰减。Cy5-Pg、Cy7-Pg的荧光强度与浓度呈正线性相关(R2=0.97)。Cy5-Pg或Cy7-Pg灌饲至小鼠体内后,在1 h、3 h时,Cy7-Pg在小鼠腹部成像的信噪比分别为Cy5-Pg的4.24倍(t=6.893,P<0.01)、3.77倍(t=4.407,P<0.05);Cy7-Pg在分离出的胃肠道内成像的信噪比为Cy5-Pg的5.19倍(t=4.418,P<0.05)。结论代谢法荧光标记不影响Pg的活性、免疫调节能力和毒性。在小动物活体成像中Cy7具有比Cy5更好的成像效果,为研究牙周炎和全身疾病的联系提供了实验基础。

知识耦合与企业技术追赶:环境动荡性的调节作用

开放合作环境下的学习是企业技术追赶的重要方式。在当前新一轮科技革命和产业变革加剧的环境下,知识耦合是否促进企业技术追赶?环境动荡性是否在其中起调节作用?利用373家中国企业的大样本问卷数据,检验了互补性和替代性知识耦合对企业技术追赶的影响。结果表明:企业互补性与替代性知识耦合对企业技术追赶有显著正向影响,表现为技术能力和市场份额的提升;环境动荡性水平提高,互补性知识耦合对技术追赶的正向作用加强,但替代性知识耦合对技术能力追赶的正向作用削弱;而环境动荡性对替代性知识耦合与市场份额追赶关系的调节效应不显著。