鸭源致病性大肠杆菌O抗原与毒力基因检测及药敏试验

【目的】探究荣昌、大足和隆昌三地鸭大肠杆菌分离株的O抗原、毒力基因及耐药性。【方法】将2014年—2021年鸭病料中分离得到的107株细菌在无菌条件下接种于麦康凯培养基中划线进行培养纯化,通过16S rDNA基因扩增测序和生化试验进行细菌鉴定,采用PCR技术对O抗原和16种毒力基因进行检测,采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行药敏试验。【结果】107株分离株鉴定为大肠杆菌;O抗原鉴定试验鉴定出9种O抗原,其中优势抗原为O78(37.00%)、O7(25.00%),O121和O145(均为15.00%),并检测到5株O78+O145和O7+O145融合株;共检测出11种毒力因子,其中强致病性毒力基因有Tsh基因(检出率为25.23%)、fyuA基因(检出率为31.78%)、estB基因(检出率为31.78%)、Vat基因(检出率为2.80%)、iucA基因(检出率为44.56%)。3种毒力基因ompA、yijP和ibeB的携带率最高,分别为100.00%、96.26%和85.98%;药敏试验结果表明分离株对氨基糖苷类药物、米诺环素和多黏菌素最为敏感,对大环内酯类药物和克林霉素耐药,分离株均为多重耐药菌,30.00%的分离株表现为7重耐药。【结论】本研究鉴定到107株鸭源致病性大肠杆菌,其致病性和耐药性较强,毒力基因携带情况和耐药性检测发现大肠杆菌的致病力与其耐药性存在一定关系;O抗原检测发现了5株新型O抗原融合株,优势O抗原不断变化,说明西南地区大肠杆菌遗传结构正发生变化,可能存在新的菌体抗原。本研究结果为中国西南地区鸭大肠杆菌病防控及疫苗制备提供依据。

重庆养鸭场雏鸭大肠杆菌分离鉴定及药敏试验

对重庆市部分县养鸭场雏鸭所发疾病进行调查,根据其临床症状、病理变化及病原分离鉴定,确诊为大肠杆菌病。从部分养鸭场分离出的细菌通过形态染色特征、生化试验、致病性试验,得到15株大肠杆菌强毒株。对15株病原菌进行药敏试验,结果表明多数菌株对丁胺卡那霉素、妥布霉素素等抗生素高度敏感;对青霉素、氨苄青霉素、四环素等不敏感。

温和气单胞菌RC-07-KA株溶血素基因克隆、表达及活性检测

为研究温和气单胞菌(A.sobria)溶血素基因的特性,本研究根据GenBank登录的气单胞菌属溶血素基因序列设计一对引物,经PCR扩增得到大小约1.5 kb的A.sobria RC-07-KA株溶血基因片段,将该片段克隆到pGEM-T载体,测序结果显示:溶血素基因片段大小为1 467 bp,编码487个氨基酸残基,遗传进化分析结果表明该基因与气单胞菌属中的A.hydrophila菌株Sb(AY611033)、NLEP A-1607(AF410466)、AEF(HM853019),A.sobria菌株357(AY157998)、人源分离株(EF620533)和A.salmonicida菌株17-2(X65048)的溶血素基因亲缘关系较近,同源性大于95%,而与其他菌株的同源性较低。通过构建溶血素重组表达质粒pET-Hly,诱导表达并通过western blot鉴定表达蛋白,结果显示重组菌能高效表达重组溶血素,而且纯化的重组溶血素具有溶解鲤鱼红细胞的活性。为该菌进一步深入研究奠定了基础。

鸭病毒性肝炎诊治及病原血清型鉴定

我们就四川省泸县某鸭场一次雏鸭暴发以急性死亡、肝脏出血为特征的传染病进行了流行病学调查、病原分离鉴定,确诊为雏鸭病毒性肝炎。利用鸭胚分离到的病毒株,经血清学中和试验证明为鸭病毒性肝炎Ⅰ型。 1 流行病学调查及病理剖检 泸县某养鸭场饲养天府肉鸭4500只,雏鸭饲养至6日龄开始出现死亡,一个星期内雏鸭死亡1200余只。发病初期雏鸭为突然死亡,后期病鸭表现精神不振。

鸭死胚细菌分离及消毒剂抑菌试验

从发病严重的三个孵房抽取死鸭胚120枚,进行细菌分离,96枚中分离到137株细菌,其中大肠杆菌64株占47％,克雷伯氏杆菌47株占34％,此外还有产气杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌共计26株,占19％。用分离的大肠杆菌和克雷伯氏杆菌涂布10日龄鸭胚蛋壳接种,可分别引起30％(3/10)和40％(4/10)胚胎死亡。结果表明:荣昌县鸭胚大量死亡的原因主要是细菌感染。本文还报道了4种消毒药对分离菌株的抑制试验结果。

鸭死胚细菌分离及抑菌试验

采取死胚严重的三个孵育房死鸭胚１２０枚，用常规细胞分离方法，获得细菌１３７株。主要细菌为大肠杆菌占４７％，克雷伯氏杆菌占３４％，其次为产气杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌。用四种可用于种蛋消毒的消毒剂进行抑菌试验，结果四种消毒剂均有一定抑菌效果，但必灭杀抑菌效果最好。

维氏气单胞菌的分离鉴定及系统进化分析

维氏气单胞菌亦被称为维罗纳气单胞菌、凡隆气单胞菌和维隆气单胞菌,该菌为近些年来发现和鉴定的一个气单胞菌新种。已知气单胞菌普遍存在于淡水、海水、淤泥和污水等环境中,世界各地均有分布，其中运动性气单胞菌构成淡水鱼类肠道中的正常菌群，嗜水气单胞菌、

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白(N)在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的观察

利用RT-PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)核衣壳蛋白N基因,将其克隆入杆状病毒供体质粒pFastBacTMDual,pFastBacTMDual-N转入DH10Bac菌中进行同源重组,经三重抗性和蓝白斑筛选,得到重组质粒Bacmid-N,将其转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rBac-N.通过间接免疫荧光试验检测显示,重组蛋白在昆虫细胞中得到表达.体外组装TGEV病毒样颗粒(VLPs)试验表明,rBac-N单独感染sf9细胞未见形成明显的病毒样颗粒,昆虫细胞内只观察到杆状病毒粒子.试验结果为探讨TGEV核衣壳蛋白在病毒装配过程中的作用提供了依据.

动物免疫学综合设计性实验教学的实践

动物免疫学实验课程是理论学习必要的补充,通过相关实验项目可以帮助学生对理论知识的理解,激发学生学习热情。教学实践表明:与传统教学模式相比较,综合设计性实验教学模式更有助于学生对理论知识的学习,更有利于学生实践能力的锻炼,符合当代培养具有创新思维专业人才的社会发展需要。

化脓隐秘杆菌间接免疫荧光方法的建立及应用

通过制备兔抗化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)高免血清,筛选固定方法、封闭液、洗涤液、抗体稀释度、抗体孵育时间等应用条件,建立一种检测化脓隐秘杆菌的间接免疫荧光方法。结果表明:用冷丙酮作固定剂,10%山羊血清作封闭液,0.05%Tween–20的0.01 mol/L pH 7.4 PBS(磷酸缓冲盐溶液)作洗涤液,兔抗化脓隐秘杆菌高免血清(一抗)1∶50稀释,37℃作用2 h,羊抗兔FITC(二抗)1∶100稀释,37℃作用2 h,草酸铵结晶紫衬染菌体3 min,对纯培养物化脓隐秘杆菌检测,可见清晰的特异性荧光,能区分溶血隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、猪链球菌;在人工感染化脓隐秘杆菌死亡小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及发病山羊临床病料中均能检出化脓隐秘杆菌。

鸭源致病性大肠杆菌四环素类耐药基因检测

对40株鸭源致病性大肠杆菌的四环素类耐药基因进行检测并分析,利用PCR技术扩增主动外排机制耐四环素类抗生素的耐药基因tet A、tet B、tet C、tet D、tet K、tet L。结果表明,tet B、tet A、tet C、tet D的检出率分别为80.0%、75.0%、55.0%、15.0%,tet K和tet L的检出率均为0%,tet B基因的检出率最高。

黄颡鱼溃疡病病原菌分离鉴定及药敏试验

溃疡病（Canker）是鱼易患的一种细菌性疾病，主要表现为局部出现红肿、出血、发炎、鱼鳞脱落、生成白色絮状物、继而溃烂，最后死亡，该病发病率高，且死亡情况明显。在鳗鱼、鲈鱼、金鱼、鲫鱼、鲤鱼等均有报道，其致病菌主要有气单胞菌属占59．1％、不动杆菌占13．3％、黄杆菌占10．8％、肠球菌占1．2％、克雷伯氏菌占1．2％。其中气单胞菌属不仅是淡水鱼类出血性败血症的主要病原菌，同时也是中华鳖、牛蛙、三角帆蚌等水生经济动物的重要致病菌。

48株大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶基因型检测

为了解重庆地区部分鸭场大肠杆菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因分布情况及抗生素的应用对鸭场环境菌的影响。本试验采用PCR技术,对48株大肠杆菌(包括20株病料分离株和28株鸭场土壤分离株)的ESBLs基因TEM、SHV、CTX-M进行检测。结果表明,TEM、SHV、CTX-M型基因在病料分离株中的检出率分别为100%、30%、25%,鸭场土壤中的检出率分别为57.1%、21.4%、28.6%。不同来源的菌株均能检测出耐药基因,且部分细菌携带两种以上耐药基因;病料分离株和鸭场土壤分离株中携带的ESBLs基因均以TEM型为主。

牛源麦氏弧菌的分离鉴定及进化分析

从肉牛上呼吸道中分离出3株细菌,通过细菌培养、形态观察、生化试验、16S r RNA鉴定及对其系统发育进化分析,结果分离菌株为麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)。药敏试验结果显示,该分离菌株对头孢类药物、左氟沙星等药物敏感,对青霉素、氨苄西林、万古霉素等药物耐药。动物致病性试验显示,接种的小鼠于24 h全部死亡。

雏鹅人工感染沙门菌的病理组织学观察

为了研究沙门菌感染雏鹅的主要病理组织学变化。采取腹腔注射沙门菌人工感染7日龄健康雏鹅,对发病雏鹅进行病理剖检,并采取肺脏、肝脏、脾脏和肠道病料制作病理切片,光学显微镜下进行病理组织学观察。受感染雏鹅剖检病变可见皮下、心肌、肺脏、脾脏、肠道、脑膜等多处出血,肝脏坏死,胆囊、脾脏肿大;显微病理组织学变化为肝、脾、肺、肠道等器官出血、细胞变性、坏死,有炎性细胞浸润。结果表明,感染沙门菌雏鹅出现了广泛性的组织损伤,同时伴随着机体各器官明显的炎症反应。

鸡体内小鹅瘟病毒垂直传播的研究(Ⅱ)

用小鹅瘟SRM_1强毒株鹅胚尿囊液、GD弱毒株鸭胚尿囊液分别接种健康产蛋鸡,经琼扩免疫扩散(GAID)试验检测,发现SRM_1强毒株于感染后5天或GD弱毒株于7天在鸡蛋卵黄中存在小鹅瘟病毒,并持续至感染后45天,用卵黄直接接种孵化12日龄的鹅胚或9日龄的鸭胚,可部分致死鹅胚和鸭胚。死亡胚胎病变明显,在尿囊液中检测出小鹅瘟病毒(GPV)抗原,经特异性阻断试验证明,沉淀线可被小鹅瘟高免血清阻断,用电镜观察卵黄抽提液超速离心沉淀物,发现大量形态完整、大小在18—25um的病毒颗粒。

一种增殖小鹅瘟病毒的方法

小鹅瘟强毒和鸭胚化弱毒可以在产蛋母鸡中增殖,并传递到卵黄中。卵黄中的病毒抗原可以用琼脂扩散试验和对流免疫电泳检出,该沉淀线可被高免血清阻断。在人工感染产蛋母鸡45天后,仍能在感染母鸡所产蛋的卵黄中检到小地瘟病毒抗原。含病毒的鸡蛋在普通冰箱中保存3个月,仍可用琼扩试验检测出卵黄中病毒抗原。该试验为小鹅瘟病毒的增殖提供了一种途径。

兔出血症病毒RC株VP60基因扩增与序列分析

本实验应用RT-PCR方法从兔出血症病毒荣昌分离株(RHDV-RC)中扩增出衣壳蛋白VP60基因并测序,从GenBank下载已发表的16株RHDV VP60序列,运用生物信息学软件分析并构建系统进化树和氨基酸序列同源性表。结果表明,RC株的VP60基因大小为506bp,GC含量为56.35%,与其它16株RHDV VP60基因核苷酸序列的同源性较高,最高达98.2%;而氨基酸序列的同源性达80%左右。

雏鹅感染烟曲霉鉴定与病理组织学观察

为确定荣昌3个养鹅场雏鹅感染的真菌种类,本研究采集病死雏鹅肺脏病变组织样本进行病原分离,对分离的真菌进行了形态学鉴定和ITS2序列PCR扩增及测序分析。结果显示:分离的真菌菌落颜色、菌丝结构、孢子无性繁殖方式均符合烟曲霉的特征,ITS2序列与GenBank的烟曲霉AF454113、AF454114、AY660923菌株同源性均为100%。分离菌株雏鹅回归试验显示,感染雏鹅气囊有真菌结节,肺泡壁增厚,毛细血管淤血,支气管管腔有脓性纤维蛋白或粘液,肝细胞变性坏死,淋巴细胞浸润等病变。肺脏主要表现为非典型肺炎,肝脏主要表现为实质性肝炎。本研究为临床诊断曲霉病提供了实验依据。

菌毒敌与石炭酸消毒效力的比较研究

采用石炭酸系数测定法、挖沟法及沉降法分别对菌毒敌和石炭酸的消毒效力进行了比较研究。结果表明,菌毒敌的石炭酸系数为3.34。菌毒敌(1:200在室内空气消毒后1小时和4小时的消除率分别为76.75%和85.81%;石炭酸(1:20)的消除率分别为50.73%和81.52%。试验表明,菌毒敌用于畜禽环境的消毒效力较石炭酸为佳。