dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖多酶催化体系的构建与优化

本研究的目的是构建高效的dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖体外合成途径。参考Actinoplanes sp.SE50/110中dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖的生物合成过程,选取了来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的D-葡萄糖-胸腺嘧啶转移酶RfbA和dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶RfbB,以及4种不同来源的氨基转移酶:来自Streptomyces venezuelae的DesI、来自大肠杆菌的GerB和WecE以及来自Shigella dysenteriae的VioA,经纯化获取了具有良好催化活性的目标蛋白。使用质谱检测各蛋白的转化效率,RfbA和RfbB的转化率分别为18.89%和98.34%;在4种氨基转移酶中VioA的反应转化率最高,可以达到41.67%。首先对RfbA催化的胸腺嘧啶转移反应进行条件优化,在最适条件下RfbA的转化率提高至32.14%。其次对VioA催化的氨基转移反应进行优化,在反应体系中加入谷氨酸脱氢酶形成催化循环,重复生成谷氨酸,推动可逆反应正向移动,转化率提高至近100%。最后扩大反应体系,得到了目标化合物dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖。本研究成功构建了高效的dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖体外合成途径,并且引入谷氨酸脱氢酶重复生成谷氨酸,极大地提高了可逆反应的转换效率。设计的体外多酶催化体系不仅可以用于获得阿卡波糖生物合成的关键中间体,也可用于获得具有类似生物合成过程的其他氨基双脱氧糖或糖核苷酸类化合物。