免疫八肽HPLC分析方法研究

[目的]研究免疫八肽AT-N的高效液相色谱分析方法。[方法]依据Fmoc固-相多肽合成原理,以不同树脂作为固相载体,分别合成免疫八肽及其乙酰化、酰胺化产物;以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相,0.1%三氟乙酸为离子对,用RP-HPLC对合成产物进行纯化,冷冻干燥后得到纯度大于95%的免疫多肽。将这3种多肽混合进行分离度试验。[结果]最终确定了免疫多肽AT-N的HPLC分析方法,使得分离度达到了定量分析要求。[结论]该研究为以后的中试生产提供了理论指导。

多聚甲醛固定对大鼠椎骨黏弹性影响的实验研究

目的观察多聚甲醛固定对大鼠椎骨黏弹性力学性能的影响,从生物力学角度寻找松质骨样品的最佳保存方式。方法选择8周龄健康雌性SD大鼠20只,手术分离获得完整的腰椎L4和L5共40只,随机平均分为固定组和对照组,固定组置于4%多聚甲醛中固定72 h,对照组置于5 m L EP管内-20℃冷冻保存。两组随机各取10只分别行应力松弛和蠕变实验,7 200 s后收集样品并通过显微CT分析其微观结构变化。结果固定组松弛蠕变曲线相比对照组更加平滑,达到稳态的时间较短,且500 s和7 200 s的松弛蠕变总量明显降低(P<0.01)。显微CT结果显示松弛蠕变实验会引起骨小梁断裂,且固定组比对照组骨小梁破坏更加严重。结论多聚甲醛固定法显著降低大鼠椎骨的黏弹性,在力学负荷下更易造成其微观结构破坏,不利于松质骨保存。

成纤维细胞生长因子2(FGF-2)诱导大鼠骨髓间充质干细胞骨架重塑

目的探讨成纤维细胞生长因子2(FGF-2)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)形态和骨架的影响。方法采用大鼠动脉内皮细胞(RAEC)和BMSC的TranswellTM隔离共培养体系,通过扫描电镜和罗丹明标记的鬼笔环肽染色观察BMSC的形态和骨架变化,ELISA检测细胞上清中的FGF-2含量;实时定量PCR检测单独和共培养后两种细胞的FGF-2 mRNA水平,共培养体系中添加FGF-2受体的抑制剂NVP-BGJ398,阻断FGF-2受体观察其对BMSC骨架的影响;单独BMSC培养基中添加重组FGF-2,验证外源性FGF-2的作用效果。结果与RAEC共培养后,BMSC逐渐拉伸、收缩,产生大量丝状伪足;在共培养体系中FGF-2含量增加且主要由RAEC分泌;FGF-2受体的抑制剂NVP-BGJ398可显著阻断BMSC骨架重塑,细胞多为短梭形,呈旋涡状排列。外源性FGF-2则促进BMSC胞体收缩、边缘拉伸,产生丝状伪足交错分布。结论RAEC分泌FGF-2诱导BMSC骨架重塑。

诱导膜复合组织工程人工骨技术修复儿童尺骨大段骨缺损1例

患者,男,13岁,主因“右侧尺骨干大段骨缺损、骨水泥填充术后5个月”入院。患者于2017年8月无明显诱因出现右前臂肿痛,到当地医院就诊,行前臂穿刺、脓液引流、给予抗生素等对症治疗,4个月后出现右前臂皮肤窦道形成,遂就诊于空军军医大学西京医院,门诊以“右尺骨骨髓炎”收住院治疗,入院后行“右尺骨干骨髓炎病灶探查清除、滴注引流、外固定架固定术”。

不同保存方式对小鼠股骨力学性能的影响

本文比较了不同保存方式对小鼠股骨力学性能的影响,以期从生物力学的角度寻找样品最佳保存方式。研究选择12周龄健康雌性C57BL/6J小鼠20只,手术分离获得完整的左、右股骨,随机分为新鲜对照组、4%多聚甲醛固定组、4℃冷藏组、-20℃冷冻组、-80℃冷冻组,其中后三组低温保存组分别在各自不同温度储存1周、2个月、6个月,复温后行三点弯曲测试,记录载荷挠度等变化。结果显示:相对于新鲜对照组的测试结果而言,4%多聚甲醛固定组,弹性模量和挠度全部明显下降;4℃冷藏组保存1周后,样品最大载荷和弹性模量有所降低;-20℃保存2个月,力学性能接近于新鲜对照组,6个月后,最大载荷降低;而-80℃冷冻组在弹性载荷、最大载荷、弹性模量等方面的力学属性未发生明显变化。因此基于本文研究结果得出结论,-80℃冷冻保存对骨组织的力学性能影响较小,适合长期保存。

免疫八肽的纯化工艺研究

目的:研究免疫八肽的纯化工艺。方法:以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相,以0.1%三氟乙酸(TFA)为离子对,用RP-HPLC(反相高效液相色谱)对合成产物进行分析,探索主峰出峰时间和杂肽分离度,优化程序后将程序放大并制备纯化,用RP-HPLC分析纯肽产物并与标准品对照其色谱保留值,结果一致,结果:此程序下收集的纯肽产物是目标八肽,并且收集的3段肽液纯度全部大于95%,产率高,纯度高。结论:建立了适于大规模生产免疫八肽(AT-N)的纯化工艺。

FK506联合供体骨髓移植诱导猪同种异体复合组织移植免疫耐受的组织病理学研究

目的改良猪带血管-骨-肌-皮肤异体复合组织移植模型，探讨FK506联合供体骨髓移植对猪同种异体复合组织移植术后移植物存活的影响及组织病理学变化。方法选择3头家养雄性长白猪和8头近交系雌性巴马香猪分别作为复合组织移植的供体和受体，将受体猪分为3组：A组：单纯免疫抑制药物组，B组：免疫抑制药物联合骨髓移植组，c组：自体异位移植对照组，A、B组每组3头，C组2头。改良制备猪异体复合骨-肌-皮肤腹股沟包埋模型，术后观察猪的一般情况，监测FK506血药浓度，通过移植物皮肤大体观察及活组织检查监测其排斥反应及存活时间。结果A组移植物分别在术后第7、9、10天因排斥反应而坏死；B组移植物分别存活至术后第80、91、114天；对照组C组移植物截至观察13期为止，仍存活良好。移植物活检HE染色及透射电镜观察显示：B组淋巴细胞浸润及免疫排斥分级较A组明显减弱。结论FK506联合供体骨髓移植可延长移植物存活时间、降低免疫排斥反应，移植物皮肤活体组织检查是诊断排斥反应的可靠依据。

血管化组织工程骨修复大鼠股骨缺损的实验研究

目的探讨血管化组织工程骨修复大鼠股骨缺损的效果。方法取20只10周龄健康SD雌性大鼠，制作大鼠左后肢股骨缺损模型。将20只大鼠随机分为2组（n=10）：A组骨缺损处植入组织工程骨，B组骨缺损处植入组织工程骨并行血管移植。分别于术后1周（n=3）、4周（／7,=3）、8周（n=3）取材，另1只备用，行放射学和组织学检测观察大鼠股骨缺损处新生骨生成和支架材料降解的情况。结果放射学结果显示：术后1周，A组与B组大鼠新生骨体积／总体积平均分别为5．47％±1．90％、8．49％±1．26％，差异无统计学意义（P〉0．05）；术后4、8周，A组大鼠新生骨体积／总体积（17．54％±2．04％、39．73％±4．01％）均显著低于B组大鼠（25．32％±2．15％、53．22％±2．94％），差异有统计学意义（P〈0．05）。术后1、4周，A组大鼠剩余支架体积／支架总体积平均分别为97．33％±2．52％、80．60％±4．00％，B组平均分别为95．67％±3．51％、75．22％±6．20％，两组间比较差异均无统计学意义（P〉0．05）；术后8周，A组大鼠剩余支架体积／支架总体积（65．46％±4．51％）显著高于B组大鼠（50．19％±4．91％），差异有统计学意义（P〈0．05）。组织学结果显示：术后8周，B组的材料与骨融合更为紧密，支架内部降解率高，成骨活性好。结论血管化组织工程骨能有效促进大鼠新生骨的形成，加速材料的降解，提高骨缺损的修复效果。

不同浓度感觉神经与运动神经匀浆提取液对大鼠骨髓基质干细胞增殖与成骨分化的影响

目的探讨不同浓度大鼠感觉、运动神经匀浆提取液对大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）增殖与成骨分化的影响。方法提取大鼠隐神经和坐骨神经肌支分别作为感觉、运动神经组织。按每10．0mg组织加入1mL成骨诱导液的比例，首先制备10．0mg／mL神经匀浆，过滤提纯后10倍稀释，制备出1．0、0．1、0．01、0．001、0．0001mg／mL神经匀浆提取液。实验分为3组：体外培养绿色荧光蛋白阳性大鼠幼鼠BMSCs，常规培养至第3代后，感觉神经组（n=18）、运动神经组（n=18）分别加入以上6种浓度梯度的感觉、运动神经匀浆500μL培养，对照组（n=3）加入500μL成骨诱导培养基培养。14d后行细胞增殖数量检测与碱性磷酸酶染色，观察BMSCs的增殖与成骨分化情况。结果细胞增殖数量检测结果显示：感觉神经组1．0、0．1mg／mL神经匀浆培养的细胞吸光度值（1．957±0．065、1．751±0．073）显著大于对照组（1．145±0．087），运动神经组10．0mg／mL神经匀浆培养的细胞吸光度值（0．304±0．619）显著小于对照组（1．145±0．087），差异均有统计学意义（P〈0．05）。碱性磷酸酶染色结果显示：感觉神经组、运动神经组细胞钙结节数量（2．667±0．816、3．000±0．632）显著少于对照组细胞（11．833±1．471），差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论感觉神经区别于运动神经，在特定浓度范围内能够促进BMSCs增殖，并可能抑制其成骨分化。

3D生物打印对明胶/海藻酸钠/硅酸镁锂复合细胞水凝胶支架成骨分化的影响

目的应用3D生物打印技术制备明胶/海藻酸钠/硅酸镁锂复合水凝胶负载骨髓间充质干细胞(BMSCs)的仿生活性组织工程支架,探讨3D生物打印对含BMSCs水凝胶支架的成骨分化作用。方法常规提取2周龄SD大鼠BMSCs并用流式细胞术鉴定,将明胶、海藻酸钠、硅酸镁锂混合,加入BMSCs后应用3D生物打印技术制备含细胞的复合水凝胶支架,应用注模法制备含细胞的非打印支架。体外实验中根据是否打印分为含细胞打印组和含细胞非打印组,每组制备12个样品,并设置单纯细胞对照组。通过扫描电镜观察复合水凝胶内部结构,冻干法测定支架膨胀率和含水量。在培养3 d后用鬼笔环肽染色观察支架内细胞活性,分别于培养1,3,7 d后进行细胞增殖与毒性检测(CCK-8)实验测定吸光度值确定细胞增殖情况和培养7,14 d后使用RT-PCR检测成骨细胞特异性转录因子(Osterix)、骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原等成骨相关基因表达。体内实验根据是否打印及是否含有细胞分四组:含细胞打印植入组、含细胞非打印植入组、不含细胞打印植入组、不含细胞非打印植入组,每组支架制备9个样品。将四组支架分别植入36只8周龄SD大鼠臀后侧肌袋,左右随机,术后2,4,8周取材分别拍摄X线片,并对8周取材组织进行HE及Masson染色观察成骨分化情况。结果流式细胞术鉴定细胞为BMSCs。水凝胶内部孔隙明显,细胞在孔隙内可自由伸展。含细胞打印组的支架膨胀率为(1 039.37±30.66)%,支架含水量为(91.21±0.26)%,与含细胞非打印组的支架膨胀率[(1 032.38±35.05)%]和支架含水量[(91.16±0.28)%]比较,差异无统计学意义(P>0.05)。在体外培养3 d水凝胶内细胞生长状态良好。体外培养1 d,各组吸光度值差异无统计学意义(P>0.05);培养3 d时,含细胞打印组和含细胞非打印组吸光度值差异无统计学意义(P>0.05),但均高于单纯细胞对照组(P<0.05);培养7 d后,含细胞打印组吸光度值(2.72±0.17)高于含细胞非打印组(2.35±0.11)(P<0.05),且均高于单纯细胞对照组(1.95±0.12)(P<0.05)。体外培养7 d,含细胞打印组和含细胞非打印组的成骨分化相关基因表达量差异无统计学意义(P>0.05),但均高于单纯细胞对照组(P<0.05);体外培养14 d后,含细胞打印组的基因表达量[Osterix(1.650±0.095)、OCN(2.725±0.091)、Ⅰ型胶原(2.024±0.091)]均高于含细胞非打印组[Osterix(1.369±0.114)、OCN(2.174±0.198)、Ⅰ型胶原(1.617±0.082)]和单纯细胞对照组[Osterix(1.031±0.094)、OCN(1.116±0.092)、Ⅰ型胶原(0.736±0.140)](P<0.05)。体内植入2周,各组X线片灰度值差异无统计学意义(P>0.05);体内植入4周和8周,含细胞打印植入组和含细胞非打印植入组X线片灰度值高于不含细胞打印植入组和不含细胞非打印植入组(P<0.01);体内植入8周,HE染色显示载细胞支架不同程度降解并且与细胞相互浸入,Masson染色可见不同程度的胶原生成。结论复合水凝胶支架可为BMSCs生长提供良好的三维环境,3D生物打印可促进BMSCs在水凝胶支架内增殖和成骨分化;负载BMSCs的生物支架在体内可缓慢降解,具有较好的异位成骨能力。

系统性生物力学评价大鼠股骨缺损修复进程的实验研究

目的系统性评估SD大鼠股骨孔性缺损在修复过程中力学性能的恢复。方法选取18只健康雌性SD大鼠，随机分为实验A组、实验B组和对照组（每组6只）。实验组构建双侧股骨干钻孔缺损模型，每侧2孔缺损；对照组行假手术处理。实验A组于术后4周取材，实验B组于术后8周取材，对照组于术后4、8周取材。对3组骨标本进行线弹性、黏弹性及疲劳测试评价，显微CT扫描测量其新生骨体积分数和骨密度，天狼星红染色观察新生骨中Ⅰ型胶原再生情况。结果实验A组股骨标本的弹性模量、最大载荷、抗压强度和条件屈服极限显著低于实验B组，实验B组又显著低于对照组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。在7200s时，实验A组股骨标本的松弛量【（14．56±0．69）MPa】和蠕变量（11．37％±0．70％）显著高于实验B组[（11．06±0．63）MPa、8．98％±0．40％】，实验B组又显著高于对照组【（6．99±0．56）MPa、5．10％±0．23％】，差异均有统计学意义（P〈0．05）。在20—200N、20—300N和20—400N的载荷振幅区间，实验A组的循环次数（6044．3±879．7、4093．3±628．5、1919．3±847．5）显著低于实验B组（10192．3±1109．1、6750．7±818．0、3376．7±671．3），实验B组又显著低于对照组（28068．3±2702．6、11788．3±1141．6、5296．3±735．0），差异均有统计学意义（P〈0．05）。显微CT扫描显示：实验A组股骨标本的骨体积分数和骨密度显著低于实验B组，实验B组又显著低于对照组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。天狼星红染色结果显示实验B组股骨缺损区域的Ⅰ型胶原纤维基本完全再生。结论采用系统的力学评价方法可真实反映出大鼠股骨孔性缺损在修复过程中力学性能恢复的特点，丰富了对骨损伤修复评价的基础研究。

经皮植入物与周围软组织整合研究进展

经皮植入物周围感染是导致植入失败及相关并发症的主要原因,良好的软组织密封和完整的上皮屏障对于抵抗外界侵扰和细菌的侵袭起到关键作用。本文从人体皮肤和天然经皮结构出发,探究这些精妙的生物结构周围复杂的整合机制,为构建更为合理的仿生植入物指明方向。经皮植入物穿透皮肤(黏膜)和软组织,启动创伤愈合反应,良好愈合是达到周围软组织密封的基础。在显微镜下观察时,上皮细胞的增殖和成纤维细胞的黏附是愈合过程的关键。通过使用不同的材料和(或)改变植入物的表面结构,可诱导成纤维细胞的黏附与长入,从而阻止上皮细胞下移。在植入物表面涂覆生物分子同样可以促进创面愈合,但尚长期随访观察。相信随着纳米技术和生物材料学的迅猛发展,经皮植入物软组织整合领域也一定会有长足的进步。