人髌腱干细胞的分离培养与鉴定

[目的]研究从人的髌腱组织中分离出肌腱干细胞,并进行体外培养扩增鉴定。[方法]通过胶原酶消化法和低密度接种培养法从人的髌腱组织中分离出肌腱干细胞。通过三期分化鉴定,分离出的肌腱干细胞具有向骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞方向分化的能力。通过流式细胞术,鉴定分离出细胞的干细胞表面标记因子的表达。通过免疫组织化学检测其肌腱细胞和软骨细胞相关蛋白的表达。[结果]从人的髌腱组织中成功分离出肌腱干细胞,大约有1.2%-1.4%分离出的细胞形成单细胞克隆。分离出的细胞表达CD44＋,CD105＋,CD29＋,CD45-,和CD14-,并具有向不同细胞分化的能力;另外,肌腱干细胞不仅表达肌腱细胞相关蛋白,如Ⅰ型胶原和tenascin C,也同时会表达软骨细胞相关的蛋白,如Sox 9和Ⅱ型胶原,但其并不表达糖氨多糖。[结论]成功分离鉴定人髌腱干细胞,虽然与间充质干细胞有相同的干细胞特性,是不同于其他间充质干细胞的一种特殊的间充质干细胞。肌腱干细胞的成功分离鉴定有利于以后干细胞相关的肌腱组织修复的研究,并有助于更好的理解肌腱干细胞在肌腱相关疾病和修复的作用。

大鼠肌腱干细胞的分离培养鉴定及拉力对其Sox-9表达的影响

目的分离培养大鼠肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)并检测其干细胞特性,观察拉力对大鼠TSCs Sox-9基因和蛋白表达的影响。方法取SPF级12周龄SD大鼠两侧髌腱,胶原酶消化,以低密度接种分离出TSCs并传代,倒置相差显微镜观察细胞形态,结晶紫染色观察克隆形态和数量,流式细胞术检测其MSCs表面标记进行鉴定。体外力学加载仪对第3代TSCs施加4%、0.17 Hz的拉力作为实验组,对照组TSCs未进行拉力加载,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测拉力对TSCs Sox-9基因和蛋白表达的影响。结果倒置相差显微镜观察示,分离出的原代细胞主要呈星状,第1代细胞呈纤维细胞状。分离出的细胞7 d后形成单细胞克隆;流式细胞仪检测示其CD29、CD44、CD90表达阳性,CD45表达阴性。荧光定量PCR和Western blot法检测示,与对照组相比,实验组拉力加载后4 h Sox-9基因水平下调、蛋白表达明显降低,24 h Sox-9基因水平上调、蛋白表达明显增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论成功分离大鼠TSCs且符合MSCs特性;拉力刺激初始抑制了Sox-9表达,但拉力刺激完全消失后Sox-9表达上升。

单轴拉力刺激对人股薄肌腱干细胞炎性因子表达的影响

目的 观察单轴拉力刺激对肌腱干细胞（TDSCs）炎性因子表达的影响.方法 通过胶原酶法和低密度接种法,从人的股薄肌腱中分离TDSCs;流式细胞术检测分离出的TDSCs的表面标记因子;体外诱导检测其多向分化能力.将细胞接种在体外细胞力学加载仪上,分别施加4％、8％和10％的单轴拉力.显微镜观察拉力刺激后的排列情况.荧光定量PCR和Western blot 观察拉力后TDSCs环氧合酶-2（COX-2）和基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的基因和蛋白表达情况.结果 从人股薄肌腱中分离出TDSCs,表达CD29、CD44和CD105阳性,CD45和CD14阴性.拉力刺激4h,TDSCs未发生重新排列.4％拉力强度下MMP-1基因表达为0.090±0.007,与0％的0.247±0.032比较显著降低（P ＜0.05）;COX-2基因表达为0.005±0.001,与0％的0.005±0.001比较差异无统计学意义（P＞0.05）.与0％拉力强度比较,8％拉力强度下MMP-1和COX-2基因表达差异均无统计学意义（8％分别为0.168±0.040和0.007±0.001,而0％分别为0.134±0.075和0.006±0.003）（P＞0.05）.10％拉力强度下MMP-1和COX-2基因表达较0％拉力强度比较差异均显著升高（10％分别为0.047±0.003和0.496±0.036,而0％分别为0.011±0.003和0.005±0.003）（P＜0.05）.蛋白表达与基因表达相一致,与0％拉力强度比较,4％拉力强度下COX-2和MMP-1蛋白表达均降低,8％拉力强度下COX-2和MMP-1蛋白表达均无明显变化,10％拉力强度下COX-2蛋白表达升高,MMP-1有微弱升高.结论 不同强度单轴拉力引起炎性因子的表达不同,低强度拉力降低炎性因子表达,高强度拉力升高炎性因子表达.