慢病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2受体的下调及生长抑制

大约30%的乳腺癌中有表皮生长因子受体家族蛋白HER2的过表达,HER2表达水平与病人的预后以及恶性程度密切相关。RNA干涉(RNAi)是最近发展起来能特异性抑制哺乳动物细胞中基因表达的新技术。在以往鉴定的对HER2有良好RNAi效应的靶序列的基础上,构建了一系列U6和H1双启动子小干涉RNA(siRNA)表达载体,并转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞定量测定了其HER2下调效应。随后,siRNA表达盒经LR重组反应被克隆入慢病毒载体中并成功包装成病毒。病毒感染SKBR3后经荧光定量PCR、蛋白印迹杂交和流式细胞仪一系列实验证明:慢病毒介导的RNAi确实能有效地下调肿瘤抗原HER2的表达,而且经慢病毒处理后细胞生长受到了抑制。为进一步阐明HER2与癌症恶化的关系以及发展新的基因治疗药物提供了新的工具。

基于公共信息资源的p185抗体人源化设计

通过计算机辅助分子设计的手段 ,综合序列分析和结构分析的结果对抗体的结构完成了计算机模拟 ,并对其进行了人源化的模建和改造 ,从而建立了一套快速可行的抗体人源化设计方案 .对一株抗p1 85neu/Her 2 单克隆抗体进行了克隆测序 ,并采用此方案进行了人源化设计 .此设计方案完全使用可公共访问的生物信息学工具和数据库 ,具有良好的实用性和推广价值 .

腺病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2的下调及生长抑制效应

目的:探讨采用腺病毒做为载体介导基于RNA干涉的针对高HER2肿瘤的基因治疗的可能性。方法:构建HER2-绿色荧光蛋白融合蛋白表达质粒pHER2-GFP,并与9种针对HER2不同靶序列的siRNA表达质粒分别共转染CHO-K1细胞,根据荧光蛋白表达量从中筛选出沉默效率最高的质粒。将筛选出的质粒转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞,检测它们对HER2表达的影响。随后,将siRNA转录单元克隆入腺病毒载体,成功包装病毒后感染SKBR3细胞,再次测定其下调HER2的效应及其对细胞生长的影响。结果:2种有效下调HER2表达的质粒被筛选出来。将此2种质粒所含siRNA转录单元包装入腺病毒后仍然保持了原有的基因沉默效应。HER2下调增加了SKBR3细胞中G1期细胞的比例,并且诱导部分细胞凋亡。MTT和细胞长期增殖抑制实验表明腺病毒介导的RNA干涉抑制了SKBR3细胞生长。结论:重组腺病毒介导的RNA干涉能够下调HER2的表达并且对高表达HER2的乳腺癌细胞有生长抑制作用。

抗HER-2嵌合抗体chA21对SKBR3细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用

目的探讨抗HER-2嵌合抗体chA21在体外抑制高表达HER-2的人乳腺癌SKBR3细胞增殖并诱导其凋亡的作用。方法采用MTT比色法、HE染色、透射电镜、流式细胞术(FCM)、原位末端标记技术(TUNEL)等方法观察和检测chA21对人乳腺癌SKBR3细胞增殖的抑制和凋亡的诱导。结果chA21(0.2～5.4mg.L^(-1))可抑制SKBR3细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用呈剂量和时间依赖性。结论chA21在体外可抑制SKBR3细胞的增殖,诱导其凋亡是其主要作用途径之一。

抗HER-2抗体诱导人卵巢癌裸小鼠移植瘤细胞凋亡及其对凋亡相关蛋白表达的影响

目的探讨Herceptin对高表达HER-2的人卵巢癌SKOV-3裸小鼠移植瘤细胞的凋亡诱导作用及其可能的分子机制。方法建立动物模型,随机分为生理盐水(NS)组和Herceptin组。给药6周后,取肿瘤组织,HE染色和电镜观察细胞凋亡;并利用组织芯片为平台,TUNEL技术检测凋亡指数,进一步应用免疫组化技术结合显微图像分析技术检测肿瘤组织中的bc l-2/bax、Fas和caspase-3的表达。结果Herceptin组肿瘤细胞凋亡指数(7.96±3.04)显著高于NS组(2.58±1.49),其bax、Fas和caspase-3的表达增加,bc l-2和NF-κB的表达及bc l-2/bax比值下降。结论Herceptin可诱导人卵巢癌SKOV-3裸小鼠移植瘤细胞凋亡,其可能的机制是上调bax、Fas和caspase-3以及抑制bc l-2和NF-κB的表达。

抗HER-2工程抗体chA21和Herceptin对人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤的抑制作用

目的研究抗HER-2工程抗体Herceptin及chA21对高表达HER-2的人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤的生长抑制作用及其机制。方法建立人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型,随机分组,Herceptin和chA21均按30 mg/kg体重每周两次静脉注射,连续6周给药,观察肿瘤生长变化,计算抑瘤率;利用组织芯片及免疫组化方法结合显微图像分析系统定量检测肿瘤细胞Ki-67和NFκB的表达。结果Herceptin(30 mg/kg)和chA21(30 mg/kg)能显著抑制SKOV3移植瘤的生长,抑瘤率分别为51.12%和30.53%。Herceptin组和chA21组肿瘤组织Ki-67和NFκB的表达显著低于对照组(P<0.01),而两组之间比较统计学无显著性差异(P>0.05)。结论chA21和Herceptin均能抑制高表达HER-2的SKOV3移植瘤的生长。通过抑制NFκB的表达而影响肿瘤细胞的增殖是其可能的共同分子机制之一。

抗HER-2嵌合抗体chA21对SKOV3细胞增殖的抑制及诱导其凋亡的作用

目的探讨抗HER-2嵌合抗体chA21在体外抑制高表达HER-2的人卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导其凋亡的作用。方法采用MTT比色法、HE染色、透射电镜、流式细胞术及TUNEL染色法等观察和检测chA21对人卵巢癌细胞SKOV3增殖抑制和凋亡的诱导作用。结果chA21(0.2mg/L^5.4mg/L)可显著抑制SKOV3细胞增殖并诱导其凋亡,其作用呈剂量和时间依赖性。结论chA21在体外可显著抑制SKOV3细胞的增殖,诱导凋亡可能是其主要的作用途径。

抗HER-2嵌合抗体chA21对卵巢癌细胞MMP-2和TIMP-2表达的影响

目的观察抗HER-2嵌合抗体chA21对卵巢癌细胞MMP-2和TIMP-2表达的影响。方法采用免疫细胞化学法检测不同质量浓度chA21(6 mg/L和12mg/L组)作用36 h后,培养的高表达HER-2人卵巢癌细胞株SKOV3中MMP-2和TIMP-2表达的变化;建立SKOV3裸小鼠移植瘤模型,制作组织芯片,观察chA21(30 mg/kg)对肿瘤组织MMP-2和TIMP-2表达的作用。结果细胞实验显示,随着chA21浓度的升高,MMP-2明显降低(P<0.01,r=-0.945),而TIMP-2显著升高(P<0.01,r=0.926),MMP-2/TIMP-2比值也明显降低(P<0.01,r=-0.945),且均呈浓度依赖性改变;裸鼠荷瘤实验结果显示,chA21能明显下调MMP-2的表达(P<0.01),上调TIMP-2的表达(P<0.01),并使MMP-2/TIMP-2明显降低(P<0.01)。结论chA21能调节高表达HER-2人卵巢癌细胞SKOV3的MMP-2和TIMP-2表达水平。

抗HER-2抗体chA21对人乳腺癌SKBR3细胞凋亡的诱导作用及其机制

目的探讨抗HER-2工程抗体chA21在体外对高表达HER-2的人乳腺癌SKBR3细胞凋亡的诱导作用及其分子机制。方法采用透射电镜和原位末端标记技术(TUNEL)观察和检测chA21对SKBR3细胞凋亡的诱导,采用免疫细胞化学技术检测凋亡相关基因bc l-2、bax、Fas及caspase-3表达的改变。结果chA21作用72 h,可见SKBR3细胞凋亡,chA21高浓度组(5.4mg/L)凋亡指数显著高于低浓度组(0.2 mg/L)(P<0.01);chA21处理组SKBR3细胞的bax、Fas及caspase-3表达增加,而bc l-2表达及bc l-2/bax比值降低,上述改变在chA21高、低两个浓度组间有显著差异(P<0.01)。结论chA21在体外可诱导SK-BR3细胞凋亡,其分子机制与调节凋亡相关基因bax、bc l-2、Fas及caspase-3的表达有关。

抗HER-2嵌合抗体chA21对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的诱导作用及其机制

目的探讨抗HER-2嵌合抗体chA 21在体外对高表达HER-2的人卵巢癌SKOV 3细胞的凋亡诱导作用及其分子机制。方法chA 21处理体外培养的SKOV 3细胞,采用透射电镜和原位末端标记技术观察和检测细胞凋亡情况;采用免疫细胞化学技术检测凋亡相关基因B cl-2、B ax、F as及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)表达情况。结果chA 21作用72h,可见SKOV 3细胞凋亡,其作用呈剂量依赖性;SKOV 3细胞B ax、F as和caspase-3表达升高、B cl-2表达下调、B cl-2/B ax降低,并呈剂量依赖性。结论chA 21在体外可诱导SKOV 3细胞凋亡,其分子机制与调节凋亡相关基因B ax、B cl-2、F as及caspase-3的表达有关。

家蚕FXPRL神经肽前体基因的体外转录

昆虫滞育激素（Ｄｉａｐａｕｓｅｈｏｒｍｏｎｅ：ＤＨ）、性信息素合成激活肽（Ｐｈｅｒｏｍｏｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ：ＰＢＡＮ）是诱导昆虫滞育和性信息素（Ｓｅｘｐｈｅｒｏｍｏｎｅ）合成的两个重要神经肽［１...

棉铃虫性信息素合成激活肽基因的检测

性信息素合成激活肽是调节昆虫性信息素合成的神经肽．根据昆虫性信息素合成激活肽的氨基酸序列保守性，合成若干引物，以棉铃虫基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ方法得到单一的扩增条带．ＲＴＰＣＲ方法从棉铃虫咽下神经结中检测出性信息素合成激活肽基因在棉铃虫基因组中不仅存在，而且表达．

丁酸钠和丙酸钠对工程CHO细胞生长代谢和嵌合抗体表达的影响

抗p185 erbB-2基因工程抗体是一种有潜力的抗肿瘤药物.以稳定表达抗p185嵌合抗体的重组工程CHO细胞株为对象,分别用不同浓度丁酸钠(0～2mmol/L)和丙酸钠(0～10mmol/L)对处在对数生长期的细胞进行处理,在连续5d的培养过程中,每隔24h取样测活细胞数量,并用ELISA检测上清中抗体含量,5d后结束培养用FACS检测细胞周期.同时还用丁酸钠和丙酸钠处理长至90%满度的细胞,然后每隔12h取样一次检测葡萄糖和乳酸的含量.结果表明丁酸钠和丙酸钠可以有效地提高嵌合抗体在工程CHO细胞中的表达,表达量最高时可达58.3～59.6mg/L,是对照组的1.5倍.同时抑制细胞生长和阻断细胞周期在G1期,并且可减少培养过程中葡萄糖的消耗和乳酸的生成.和丁酸钠相比,丙酸钠具有较小的细胞毒性,是一种有潜力的替代品.

富含二硫键的膜蛋白p185胞外区在大肠杆菌中的可溶性表达和性质鉴定

Her2/c_erbB_2基因(其产物为膜蛋白p185)是表皮生长因子受体(EGFR)基因家族的一员,在约30%的乳腺癌中发现了其过量表达。为了鉴定抗p185单克隆抗体的抗原表位并进一步研究它们的相互作用,采用PCR的方法从含Her2/c_erbB_2基因的pBabe/erbB_2质粒中扩增了p185胞外区的富含二硫键的第一、二结构域和第四个结构域。产物克隆到pGEX/4T_1载体后,转化大肠杆菌OrigamiB(DE3)pLysS菌株,用低浓度IPTG进行低温过夜诱导后将菌体压力破碎,SDS_PAGE检测表达上清,得到了可溶性表达的融合有GST的目的蛋白。经ELISA、Westernblot等方法鉴定,可溶性表达产物具有完全的抗体结合活性,且当用凝血酶把GST切掉后该活性仍然保留。p185胞外区融合蛋白的成功表达将为二硫键富含类蛋白的表达提供参考;并为将来具有肿瘤细胞生长抑制活性的抗p185单克隆抗体的抗原表位鉴定,以及为EGFR家族受体的结构和功能关系的研究打下基础。

抗P185工程抗体表达与纯化研究

人类的原癌基因Her-2编码一个185kDa的跨膜受体酪氨酸激酶,也称为p185,是肿瘤相关蛋白,在多种癌细胞,特别在乳腺癌中有高表达。构建了抗p185/HER-2的二价的嵌合抗体(scFv-Fc),并证明其保留了亲本抗体的特异结合活性,进而建立了高表达的细胞株。对该嵌合抗体进行滚瓶大规模培养,并对培养产物的纯化条件进行了摸索,建立了亲和层析和阳离子交换层析两步法。最终产物的纯度在95%以上,回收率为63%。摸索了嵌合抗体的冻干保存条件,抗体可以保持其稳定性和结合活性一年以上。嵌合抗体纯化工艺和保存条件的确定,为进一步的临床研究奠定了基础。

蛇毒C型凝集素类似蛋白Agkisacutacin单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备并鉴定抗蛇毒C型凝聚素类蛋白Agkisacutacin的单克隆抗体(mAb)。方法:以Agkisacutacin蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过常规的细胞融合方法制备抗Agkisacutacin蛋白的mAb。用间接ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性。用荧光染色法做杂交瘤细胞的核型分析。用Western blot检测mAb的特异性。结果:获得3株可稳定分泌抗AgkisacutacinmAb的杂交瘤细胞株。结论:成功制备了抗Agkisacutacin的mAb,为检测Agkisacutacin蛋白作为新型抗血栓药物的体内代谢规律的方法和研究抗血栓的机制提供了重要的工具。

p185高表达人卵巢癌裸鼠模型的建立

目的建立高表达p185的人卵巢癌裸鼠模型。方法BALB/c裸鼠皮下接种高表达p185的人卵巢癌细胞株SKOV3,观察成瘤情况及移植瘤病理组织学特点,并用SP免疫组织化学法测定移植瘤的p185表达情况。结果12只裸鼠均荷瘤成功,病理组织学与免疫组化均证实移植瘤保持了原细胞系特征。结论高表达p185人卵巢癌裸鼠模型的成功建立为抗p185抗体药物的体内药效研究提供了理想的平台。

基因工程抗体增强紫杉醇诱导乳腺癌细胞SKBr3凋亡的作用

目的探讨抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体增强化疗药物紫杉醇诱导p185高表达的人恶性乳腺癌细胞系SKBr3凋亡的效应及其机制。方法采用MTS法检测基因工程抗体、紫杉醇及两者联合对SKBr3细胞增殖的抑制作用;用AnnexinV-FITC/PI法和流式细胞术定量分析SKBr3细胞的凋亡率;用Western blot技术分别检测AKt的Ser473位点、NF-κBp65亚基的磷酸化水平;用EMSA分析SKBr3细胞核内NF-κB与DNA的结合活性。结果基因工程抗体可增强紫杉醇对SKBr3细胞增殖的抑制作用,并可诱导细胞凋亡;基因工程抗体联合紫杉醇并可显著抑制SKBr3细胞中AKt/NF-κB途径。结论紫杉醇诱导乳腺癌细胞SKBr3凋亡的同时,可能通过激活AKt/NF-κB途径使癌细胞对紫杉醇产生耐药性。抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体联合紫杉醇是通过抑制AKt/NF-κB途径而增强紫杉醇诱导癌细胞凋亡的作用。

中国健康汉族人基因组DNA中干扰素α1和干扰素α2等位基因组成的测定

人类干扰素α1和干扰素α2目前均发现有3个等位基因,干扰素α1有IFNαD、IFNα1和IFNα1/158Val3个等位基因,干扰素α2有IFNα2a、IFNα2b和IFNα2c3个等位基因,但迄今尚没有关于这两种干扰素基因变异体在中国汉族人群中组成的报道,研究意在探明这两种干扰素基因变异体分别在中国汉族人群中的分布情况。通过随机抽取100例健康中国汉族人外周血白细胞基因组DNA,采用自行设计的引物通过PCR方法扩增出干扰素α1和干扰素α2基因片段,采用第一代全自动DNA测序的方法测定出扩增的干扰素α1和干扰素α2基因片段的核苷酸序列。测序分析表明,在100例中国健康人群中仅检测出IFNα1和IFNα2b基因,且所有志愿者两种基因编码区核苷酸序列均完全相同,没有检测出干扰素α1和干扰素α2基因的其他变异体。提示IFNα1和IFNα2b分别是中国汉族人干扰素a1和干扰素a2的优势等位基因,适合中国人使用。

310例中国人基因组干扰素α1/α2基因多态性研究

目的若药品α-干扰素亚型与人体体内基因型不一致,接受抗病毒治疗的患者可被诱导产生更多的抗干扰素中和抗体,导致不应答和治疗失败。通过分析中国人群干扰素α1(IFNA1)和α2(IFNA2)基因多态性,可帮助阐明重组人干扰素α1和α2在中国人群中的遗传背景,为临床用药提供参考。方法在单核苷酸多态性数据库中分别检索IFNA1基因和IFNA2基因编码区错义突变单核苷酸多态性(SNP)位点,再在千人基因组数据库查询收录的中国人IFNA1和IFNA2等位基因的分布情况,分析两种基因多态性并计算出相关的等位基因频率。结果在千人基因组数据库共收录310例中国人双倍染色体基因组序列,所有中国人均有IFNA1和IFNA2基因座,其中,IFNA1基因座含有IFNα1、IFNα1(Ala137Val)和IFNα1(Arg148Gln)三种等位基因,基因频率分别为99.6%、0.2%和0.2%;IFNA2基因座也含有IFNα2b、IFNα2b(Leu140Val)和IFNα2b(Ala120Thr)三种等位基因,基因频率分别为98.4%、0.2%和1.4%。结论IFNα1和IFNα2b分别是中国人群IFNA1和IFNA2基因座的优势等位基因,在我国批准上市的IFNα1b、IFNα2a和IFNα2b三种亚型α-干扰素中,仅有IFNα2b与中国人基因型一致。