副溶血性弧菌快速检测方法研究

目的以检测toxR基因作为副溶血性弧菌种水平上的特异性基因鉴定,建立一种快速、准确、简便的副溶血性弧菌(VP)筛选方法。方法根据toxR基因序列设计合成引物,扩增被检VP所含的相应基因。分别用标准株及地方株做对照,同时与常规鉴定方法比较。结果对浙江省2005年收集的286株来自临床病人和海产品的可疑VP鉴定,用常规方法鉴定出VP占总数的62.24%;用toxR基因检测,鉴定率占所有菌株的61.54%;两者差异无统计学意义(χ2=0.03,P>0.05),对40份海产品增菌液直接检测toxR基因与常规增菌分离鉴定法,均有37份标本检出VP,检出率为92.5%。结论该检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为VP快速筛选方法。

海水产品副溶血性弧菌污染定量检测分析

目的:为了掌握副溶血性弧菌在海水产品中污染情况,以不同季节,定量检测副溶血性弧菌在海水产品中污染程度的动态变化,提出有效的控制措施,减少食物中毒的发生。方法:根据不同季节,从不同的农贸市场采取鱼类、虾类标本;采用MPN法进行副溶血性弧菌定量检测;并完成分离菌株血清型和毒力基因的检测。结果:副溶血性弧菌在海水产品中的污染有明显的季节性,并且与我省的细菌性食物中毒的发生季节基本一致;副溶血性弧菌的血清型分布以O4/O5/O1/O11血清型为主;海产品分离株,其携带TDH基因明显低于食物中毒标本中分离株。结论:通过检测分析,得出副溶菌在鱼虾等海产品中的污染具有明显的季节性,虾和鱼的污染密度也有差别(2χ=12.40;P<0.05)。而且检测的两类海产品中,高污染量的副溶菌对食品安全存在高风险。加强对TDH阳性副溶菌的检测,是控制副溶菌食物中毒发生的重要方面。

副溶血性弧菌食物中毒菌株的血清型、耐药性及基因检测

〔目的〕副溶血性弧菌是常见的食物中毒病原菌,通过对副溶血性弧菌食物中毒菌株的血清型、耐药和tdh（耐热溶血素）trh（耐热相关溶血素）、基因检测,了解本省的副溶血性弧菌食物中毒菌株的主要血清型及相关生物学特征。〔方法〕利用17种不同的抗生素药敏纸片,采用平皿法进行耐药检测;用PCR扩增法,以检测菌株的tdh和trh基因;采用血清凝集试验对菌株进行血清型分型。〔结果〕经检测的50株菌株,显示对β-内酰胺族（如青霉素及头孢等）部分或完全耐药,对氨基糖苷族（如庆大霉素及妥布霉素）、酮诺喹族（如环丙沙星）以及氯霉素等抗生素为敏感反应;对50株菌株其血清型分布于6个O群抗原,而血清型有15个以上。中毒菌株血清型由80年代的O1、O4、O5为主,到90年代以O3、O1、O4为主的变化,其中O3:K6血清型菌株引起的食物中毒有所增加。〔结论〕所检测的50株菌株均有tdh基因,未检到trh基因。

不同来源的副溶血性弧菌生物学特性研究

为掌握浙江省不同来源的副溶血性弧菌的血清型分布及毒力基因携带情况,采用血清凝集试验对333株副溶血性弧菌进行血清型分型,采用PCR技术检测副溶血性弧菌的毒力基因TDH。临床副溶血性弧菌菌株血清型分布于7个O抗原群,以O3为主,占临床菌株数的71.81%;O4血清型与往年相比有所上升,占到了16.60%。海产品菌株的血清型分布于8个O抗原群,以O5为主,占所有海产品菌株的47.30%。临床菌株的TDH检出率为95.65%,海产品菌株的TDH检出率为6.06%。血清型相同但来源不同的菌株的TDH检出率不同。浙江省从海产品中分离出的副溶血性弧菌菌株与分离自食源性疾病患者的副溶血性弧菌菌株的主要血清型、毒力基因TDH都存在差别。该工作为预防副溶血性弧菌引起的食品中毒提供了科学依据。

不同来源STECO157:H7生物学特性研究

目的探讨浙江省产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7菌株PFGE分型及携带毒力基因以及耐药情况。方法菌株生化、血清鉴定按API20E鉴定系统;大肠杆菌O157:H7诊断血清凝集试验;采用聚合酶链反应(PCR)法检测O、H抗原及毒力基因SLT1、SLT2、Hly、eaeA;STECO157:H7分型用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行;14种抗生素进行药敏试验采用K-B法。结果5株可疑菌株经生化和血清鉴定符合O157:H7特性;毒力基因检测所有分离株SLT2、Hly、eaeA三种毒力基因均阳性而SLT1均阴性;脉冲场凝胶电泳分型结果显示,有2株菌PFGE电泳条带完全相同,其余3株菌电泳条带不同,5株菌共分为4个带型;经耐药性分析,菌株对头孢噻吩、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星100%敏感;对复方新诺明、氨苄西林100%耐药。结论STEC 0157:H7菌株在浙江省一些地区存在,并且携带SLT2毒力基因,PFGE型别较多,同时也有人间感染病例的出现,提示应加强O157:H7监测力度,防止该菌在人间的感染和流行。

实验室菌落计数精密度控制的研究——Ⅰ影响精密度的因素

为提高食品中菌落总数测定的准确性 ,采用 7组实验人员对含菌量在一定范围内的标本同时检测 ;不同实验人员对同一批平皿菌落数进行计数比对 ,实验者对同一份标本进行重复加样检验 ,以统计学方法对实验数据进行分析。通过多个实验表明 ,试样的均衡性、读数误差控制范围的正确确定以及样本菌量的正确估计 ,都是影响实验室菌落计数精密度控制的因素。提示今后应针对这些影响因素 。

城镇居民主要腹泻病原菌现状研究

〔目的〕掌握我省城镇居民的主要腹泻病原菌 ,为建立食源性疾病主动监测体系 ,提供必要的监测数据。〔方法〕采集监测点腹泻门诊腹泻患者粪便 (或肛拭 )标本 ,分离沙门菌、志贺菌、霍乱、肠出血性大肠O157∶H7及副溶血性弧菌 5种病原菌。〔结果〕15 70份标本共分离各类病原菌 2 2 3株 (14 .65 % ) ,其中 ,以副溶血性弧菌检出率为最高 ,占总检出率的 85 .65 % ,志贺菌、沙门菌的检出率分别为 3 .14 %和 0 .45 % ,霍乱、肠出血性大肠O157∶H7未检出 ;女性患者病原菌检出率显著高于男性患者 (P <0 .0 1) ;60 .0 9%的患者年龄集中在 2 0～ 40岁 (P <0 .0 0 1) :副溶血性弧菌流行的血清型主要为O3 血清型。〔结论〕我省城镇居民主要致泻病原菌为副溶血性弧菌且仍为O3 血清型 ,患者主要为中青年。

浙江省沿海河豚鱼生态分布和毒素检测

目的 了解我省沿海河豚鱼毒性分布情况 ,为控制和降低中毒事件发生 ,合理开发河豚鱼资源。方法 采用生物学鉴定方法分别测量体长、体重、性腺识别和称重、观察鱼体的斑纹 (斑点 )等鉴定鱼种。采用直接竞争抑制ELISA法 ,测定河豚鱼肌肉、性腺、肝、皮的带毒情况。结果 采集的河豚鱼种类共有 9种 ,以黄鳍东方豚为主 ,占 63 0 2 % ;季节分布以 4、 5、 6月获得的标本为多 ,占总数的 5 4 62 %。带毒检测中 ,8份TTX含量较高的标本分别为菊黄东方豚的肝、皮部位 ,分别达 44 5鼠单位 ,按东方河豚毒素毒力单位判定 ,可判为“强毒”等级 ;黄鳍东方豚其TTX含量较低。结论 菊黄东方豚是我省常见的河豚鱼种类之一 ,毒素检测显示其皮及肝脏为强毒 ,应加强对这一鱼种的识别和控制食用。

实验室菌落计数精密度控制研究-Ⅱ方法研究

为使室间及室内检测数据的准确度及精密度控制控制在一定的范围,保证相关的卫生微生物实验室出具准确的检测数据,选用明胶菌片作为菌落计数室间及室内质控比对品。随机抽取明胶菌片和滤纸菌片各10片进行计数检测;取同一批号的明胶菌片发放给不同实验室进行室间比对;明胶菌片分别经1个月、3个月及6个月保存后进行稳定性计数测定。结果显示同一批次明胶菌片和滤纸菌片的相对标准偏差(RSD)分别为11%和223%,表明明胶菌片的精密度高于滤纸菌片;75个实验室室间明胶菌片计数结果95%的可信区间为551×107～803×107CFU片,有9683%的单位在此范围中;明胶菌片4℃冰箱保存1、3、6个月的检测结果的均数误差差异无显著性。采用明胶菌片作为菌落计数质控比对品,在精密度、准确度及可操作性方面都能达到相应的要求。

一起食物中毒病原菌的检验分析

某县在1995年10月,由于该地一村民建房上梁,自制汤团供帮工及前来祝贺人员食用,食用后引起56人发病,患者出现发热、腹痛、腹泄(部分人员),恶心,头痛等症状。为此,本实验室对上送标本进行检验。材料与方法1.培养基,实验中所用的有关培养按GB4789.28-94方法配制。用于沙门氏菌分型鉴定的血清为兰州生物制品研究所生产。2.标本来源:被检标本为剩作余成型汤团、汤团粉、红糖、盛装汤团粉的布袋(以下称布袋)共计4份标本。均由基层卫生防疫站上送。3.取样方法:汤团、汤团粉、红糖按GB4789-94方法中有关项目检验的要求进行取样。布袋采用涂抹法:取经灭菌生理盐水浸湿的棉签涂布袋内侧约100平方厘米,每涂抹约20平方厘米换一根棉签,抹后将棉签头剪入100毫升磷酸缓冲白胨水中,进和预增菌。

干扰NLRP3及NLRP12对IL-6诱导全身型幼年特发性关节炎滑膜成纤维细胞增殖影响及机制研究

目的:全身型幼年特发性关节炎(systemic juvenile idiopathic arthritis,sJIA)目前免疫机制尚不明确。本研究旨在探讨炎症小体对白介素(IL)6诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维(Rheumatoid Arthritis Synovial Fibroblasts,RASF)细胞增殖及炎症因子分泌的影响。方法:构建IL-6诱导的RASF细胞增殖模型和设计合成2条核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白(NOD-like receptor protein)3和NLRP12的siRNA干扰片段,通过脂质体转染RASF细胞,建立NLRP3,NLRP12干扰的细胞株;实时荧光定量PCR和ELISA检测NLRP3、NLRP12 mRNA及炎症因子IL-1,IL-18,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达;再用IL-6处理细胞,MMT法检测细胞增殖;qPCR检测NLRP通路相关分子及核因子κB(NF-κB)p65,核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)表达的影响。结果:IL-6呈剂量依赖性诱导的RASF细胞增殖增殖,NLRP3 mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),NLRP12较对照组无明显变化(P>0.05);转染siRNA后可显著降低NLRP3,NLRP12在RASF细胞内mRNA的表达(P<0.05),且NLRP3表达降低后会抑制IL-6诱导的RASF细胞增殖,而抑制NLRP12则促进IL-6诱导的RASF细胞增殖。结论:NLRP3与促进IL-6诱导的RASF细胞增殖有关,NLRP12可能参与抑制RASF细胞增殖。

浙江省O157大肠杆菌监测及其分子生物学特性

目的了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7和其他O157大肠杆菌在浙江省动物、人群中的分布、流行以及PFGE分型、毒力基因携带状况。方法按全国O157∶H7监测方案在5-10月份肠道传染病高发季节,采集全省各地(市)肠道门诊腹泻病人粪便,进行O157大肠杆菌分离培养,并用免疫磁珠分离法对浙江省5个监测点的宿主动物进行O157∶H7分离培养、鉴定,可疑菌株以PCR法检测O157∶H7抗原、志贺样毒素(stx1和stx2)、粘附抹平因子(eaeA)及溶血素(hly)4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行同源性分析,同时选择14种抗生素进行药敏试验,并将分析结果与本省首株患者粪便中分离的产志贺样毒素的O157∶H7菌株进行比较。结果全省5个监测点2006年共监测动物粪便标本2377份,分离到4株O157∶H7菌株,阳性率为0.17%;同时在绍兴、舟山肠道门诊腹泻病人粪便中分离到2株O157:H?菌株。4株O157∶H7菌株,stx2、Hly、eaeA均阳性,stx1均阴性;2株O157∶H?菌株仅1株携带eaeA毒力基因。脉冲场凝胶电泳分型显示,4株O157∶H7菌株分3个型,除金华地区2006年分离所得2株完全相似外,其它相同地区不同年代分离的O157∶H7菌株及相同年代不同地区分离的O157∶H7菌株则完全不相似。2株O157∶H?菌株1株PF-GE电泳条带降解,另1株与其它O157∶H7菌株电泳条带差异明显。结论浙江省大肠杆菌0157菌株在动物中以携带stx2毒力基因的O157∶H7菌株为主,但在腹泻患者中则以不带志贺样毒素的O157∶H?菌株为主。不同地区分离的O157∶H7菌株PFGE分型差异明显。羊、奶牛是携带stx2毒力基因的O157∶H7大肠杆菌的主要宿主。各级疾控应加强对宿主动物和腹泻病人大肠杆菌O157的分离监测和流行病学调查。

实时PCR在大肠杆菌O157∶H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157∶H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157∶H7大肠杆菌rfbE基因序列,应用分子生物学软件进行序列比对,在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157∶H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157∶H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1cfu/μL,重复性检测的变异系数均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×102cfu/μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于大肠杆菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。

肠炎血清型沙门菌多重PCR检测方法的建立及应用

目的为临床确诊及基层实验室快速准确鉴定肠炎血清型沙门菌提供实验室支持,同时为沙门菌传统血清学鉴定方法提供技术补充。方法根据沙门菌菌体抗原A/D1群基因、鞭毛抗原基因(fliC-HG)及肠炎沙门菌特异性基因片段(sdfI)设计引物,建立多重PCR体系并进行反应条件优化。对所建立的体系的特异性进行检测,并将该体系应用于浙江省2009-2010年分离的共计53株样本的检测。结果建立并优化了肠炎沙门菌检测的多重PCR体系,该体系具有高特异性,可准确快速鉴定肠炎血清型沙门菌,也可区分A群及D1群血清群的沙门菌,并能检测鞭毛抗原为HG的沙门菌,对实际样本检测符合率达100%。结论该体系能正确鉴定肠炎血清型沙门菌,可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法,可弥补商品化血清质量参差不齐的缺陷。并为肠炎沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、重复性好的新方法。

金黄色葡萄球菌食品和病人分离株肠毒素基因和耐药性比较

目的:对金黄色葡萄球菌食品(不含生牛奶)分离株和病人分离株的肠毒素基因进行分型和耐药性检测,比较两种分离菌株的肠毒素基因分布和耐药性差异。方法:用国标方法分离鉴定金黄色葡萄球菌,VITEK32生化验证,PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因(肠毒素SEA-SEJ基因),VITEK32测定分离菌株抗生素的耐药性。结果:从病人分离的80株金黄色葡萄球菌检测到9种基因。肠毒素基因携带率为85.0%,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占76.3%,含传统肠毒素基因(SEA-SEE)的菌株占43.8%,有新发现肠毒素基因(SEG-SEJ)的菌株占71.3%。从食品中分离的51株金黄色葡萄球菌检测到7种肠毒素基因。肠毒素基因携带率为68.7%,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占21.6%。有SEA基因的占27.5%,含其它传统的毒素基因类型(SEB-SEE)基因的菌株占23.5%,携带新发现的毒素基因SEG、SEH、SEI的菌株只占9.8%。金黄色葡萄球菌病人分离株与食品分离株的耐药谱和耐药率有较大差异。结论:金黄色葡萄球菌食品分离株和病人分离株的肠毒素基因分布不同,其耐药性有明显区别。

浙江省在蜱中检测到斑点热群——立克次体DNA片段

目的了解蜱、鼠中自然感染斑点热群立克次体的状况。方法用聚合酶链反应(PCR)检测鼠类脾脏和蜱类中的斑点热DNA片段。结果在金华市金东区捕获社鼠2只,黄毛鼠10只,黑线姬鼠4只,用PCR检测结果均为阴性。用PCR检测49只中华硬蜱,阳性8只,阳性率16.33%。结论初步认定浙江省存在斑点热病原,尚需进一步调查。

2000—2004年浙江省食品中产单核李斯特菌污染状况调查

目的：掌握浙江省食品中产单核李斯特菌污染状况。以及内化素基因（Inl）和李氏溶血素O（Hly）两种致病基因携带情况。方法：按GB4789．30方法分离单增生李斯特菌，采用PCR技术检测李斯特菌的两种致病基因。结果：2000～2004年从2282份食品中共分离产单核李斯特菌163株，总污染率为7．14％（163／2282）。生肉类、熟肉及水产品的污染率分别为12．80％、7．67％和2．24％；114份生食蔬菜中1份标本分离到产单核李斯特菌；285份乳及乳制品、59份冰激凌均未分离到产单核李斯特菌；163株产单核李斯特菌有155株同时检测到内化素基因和李氏溶血素O基因。结论：我省存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险。