异育银鲫过氧化物还原酶基因的克隆及其表达分析

采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增技术从异育银鲫Carassius auratus gibelio肝脏中克隆了过氧化物还原酶(Prx)基因的cDNA全长序列。结果显示,异育银鲫过氧化物还原酶(CaPrx)基因cDNA全长1035 bp,开放阅读框长594 bp,编码197个氨基酸。在氨基酸序列的N端和C端各有一个保守的Cys残基,属于2-半胱氨酸类Prxs家族。多序列比对和系统进化树分析表明,异育银鲫与鲫Carassius auratus、青鱼Mylopharyngodon piceus、斑马鱼Danio rerio、犀角金线鲃Sinocyclocheilus rhinocerous和朝鲜鳑鲏Rhodeus uyekii等鱼类的Prx基因具有很高的同源性。实时荧光定量PCR结果显示,CaPrx基因在异育银鲫体内广泛表达,在血细胞和肝脏中表达量最高,在鳃和头肾的表达量较少。在感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的个体中,肝脏和脾脏的CaPrx基因表达量显著下降,表明其抗氧化作用因病毒的感染而受到了一定的破坏。

鳀鱼鱼浆的酶解过程与营养成分的变化

为了分析以冰冻鳀鱼为原料制备鱼浆用于饲料中,在55℃下设置鱼浆自溶组(C组)、添加抗生素组(A组)、添加外源木瓜蛋白酶组(E组)、同时添加抗生素和木瓜蛋白酶组(E+A组)共4个试验组,以游离氨基酸、生物胺、挥发性盐基氮、脂肪酸、丙二醛、过氧化值和酸价为评价指标,探讨酶解过程中营养物质的变化规律和酶解条件。试验结果表明,在55℃条件下,以游离态氨基氮生成量、细菌总数作为判别指标,鳀鱼自溶酶解的最佳时间为7~9 h;酶解完成后,蛋白质类生成物变化为:各组游离氨基酸、挥发性盐基氮、尸胺含量显著升高,游离氨基酸为14.97 g/100 g左右(干物质);组胺、腐胺、精胺、亚精胺含量降低。脂肪类成分的变化为:不饱和脂肪酸部分转化为饱和脂肪酸,酸价、丙二醛、过氧化值与原料鱼差别不大。在55℃下鳀鱼蛋白质酶解迅速,游离氨基酸生成率高,油脂氧化程度低;酶解9 h蛋白质的腐败和油脂的氧化主要受内源性组织酶作用,外源木瓜蛋白酶、微生物影响较小。

池塘环境中异育银鲫鲤疱疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)的检测与传播途径分析

以发生鲫鱼鳃出血病的4个池塘为对象,以鱼体肝、胰、脾、肾脏的混合物、鲫鱼体表黏液、鲫鱼鱼卵和水体浮游生物为试验材料,采用PCR扩增后电泳检测239 bp的鲤疱疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)特异条带的方法,证实这4个池塘发生了CyHV-2病,鲫鱼肝、胰、脾、肾脏中含有CyHV-2;鲫鱼体表黏液中检测到CyHV-2,在部分雌性鲫鱼个体的卵巢中也检测到了CyHV-2,提示通过鱼体体表黏液在鱼体之间、通过鱼卵向鱼苗传播CyHV-2的可能性。在鲢鱼内脏中检测到CyHV-2,而其他种类如草鱼、鳙鱼、野杂鱼,以及浮游生物中没有检测到CyHV-2,提示通过池塘中其他种类传播CyHV-2的可能性,但主要传播途径还是依赖鲫鱼的体表黏液进行横向传播,通过鱼卵进行纵向传播的可能性。

注射热休克蛋白促进剂或抑制剂后异育银鲫感染CyHV-2时生理状态的响应

鉴于异育银鲫鳃出血病与温度相关的发病特征,分别对异育银鲫注射HSP70抑制剂和促进剂进行了其体内热休克蛋白的人工干预。研究发现,养殖池塘自然发病的具有鳃出血病典型症状的异育银鲫,其肝脏内HSP70基因的表达量与健康异育银鲫相比明显升高,人工感染CyHV-2病毒后,肝脏内HSP70表达量在24h后显著增加,当鱼体表现出发病症状时,HSP70表达量极显著上升。对照组在人工感染CyHV-2后,血清中天门冬氨酸氨基转移酶在鱼体发病时显著升高,且在发病时与注射促进剂和抑制剂组都有极显著差异;注射HSP70促进剂组在人工感染CyHV-2后,血清中天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶在12h时显著升高。注射HSP70抑制剂的异育银鲫体内病毒数在感染病毒后12h时,就达到最高点,明显高于对照组及注射促进剂组的同时间段病毒数。说明HSP70在抵御病毒的增殖中具有一定的积极作用。

基于不同PCR方法的Ⅱ型鲤疱疹病毒检测技术研究

异育银鲫"鳃出血病"是一种因感染了鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)而引起的疾病,近年来给江苏异育银鲫养殖业造成了巨大的经济损失。为了能够建立及时、有效检出Ⅱ型鲤疱疹病毒的技术,本研究在克隆了Cy HV-2解旋酶基因和三联体蛋白基因的基础上,建立了检测CyHV-2的普通PCR、双重PCR、巢式PCR、环介导等温扩增、实时荧光定量PCR等方法,并对这5种PCR技术检测Cy HV-2的灵敏性进行了系统研究。结果表明,针对CyHV-2病毒的解旋酶基因和三联体蛋白基因,普通PCR能够检测出的极限值是2.4×10~4 copies/μL,双重PCR是1.4×10~4 copies/μL,巢式PCR是2.4×10^(-2)copies/μL,荧光定量PCR是2.4×10^(-2)copies/μL,环介导等温扩增是3.5×10~2 copies/μL。通过采用以上方法对从不同地区采集的54尾异育银鲫提取的DNA为模板进行临床检验,测定不同检测方法的阳性检出率。结果表明,实时荧光定量PCR和巢式PCR的检出率很高,分别为89%和90.7%;普通PCR的检出率最低,为68.5%。综合检测灵敏度和阳性检出率,环介导等温扩增(LAMP)是一种适用于生产实践的能有效检测CyHV-2的良好技术。