标本溶血对阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血生化项目检测影响的实验室处理路径研究

目的 探讨标本溶血对阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血生化项目检测结果的影响及这类患者血标本的实验室处理路径。方法 选取南京医科大学第一附属医院体检中心2022年11月至2023年4月健康体检者共275例。使用25例血标本制备模拟溶血液。根据溶血指数筛选溶血检测偏倚(B_(H))大的血生化项目,分别建立血清溶血校正方程。收集250例血浆和血清标本,计算各指定生化项目在不同标本类型间的血清检测偏倚(B_(S)),再与规定的项目分析偏倚(B_(A))比较,分别建立血浆参考区间。结果 11个血生化项目的检测结果易受标本溶血影响。以溶血指数为横坐标,B_(H)均值为纵坐标,建立了天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转肽酶、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶、α-羟丁酸脱氢酶、总蛋白(TP)、肌酐和钾离子(K^(+))共计8个项目的血清溶血校正方程,R~2值均>0.90。由于AST、LDH、TP、磷和K^(+)的B_(S)均>适当B_(A),分别建立血浆参考区间,依次为(21.9±10.5)U/L,(166±58)U/L,(71.3±10.8)g/L,(1.14±0.37)mmol/L和(3.66±0.61)mmol/L。结论 在一定溶血程度内,可使用血清溶血校正方程纠正部分血生化项目检测结果。建议优先使用患者血浆进行检测,再参照各项目的血浆参考区间以获得更准确的报告结果。

定量检测血浆DNA水平评估非小细胞肺癌患者术后复发的价值

目的探讨定量检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者手术前后的血浆DNA水平对术后复发的预测能力。方法采集做肺癌根治术的40名NSCLC患者术前2～14d（中住天数：6d）及术后5～16d（中位天数：8d）的静脉血，采用含内参照双重荧光定量PCR技术，进行血浆DNA定量检测。结果血浆DNA含量在100名健康对照者为18．5（15．5～24．9）ng／ml，在NSCLC患者术前为66．5（49．4—76．4）ng／ml，术后为56．9（43．1～89．6）ng／ml，均显著高于健康对照组（P〈0．001）。29例未复发患者，术后血浆DNA水平显著降低（P〈0．001），11例复发患者手术前后DNA水平无显著差异（P=0．131）。血浆DNA定量对NSCLC患者术后复发的诊断效能，在术前AUC：0．448，术后AUC：0．868，术后显著优于术前（P=0．002）。以术后血浆DNA≥73．3ng／ml作为临界值，预测复发的敏感性：81．8％，特异性：82．8％，阳性预测值：64．3％，阴性预测值192．3％。结论术后1—2周测定血浆DNA可对NSCLC患者术后复发进行评估，远早于常用的检查技术，具有重要的临床应用价值。

miR-206-3p在小鼠皮肤中的表达及其作用

目的对小鼠皮肤中miR-206-3p及其靶基因脑源性神经营养因子(Bdnf)进行表达与定位检测,以探讨其在皮肤发育过程中的可能作用。方法手术剪取13.5 dpc(交配后天数)、15.5 dpc、17.5 dpc胎鼠,1 dpp(出生后天数)、4 dpp乳鼠及16周龄雄鼠的背部全层皮肤,用实时荧光定量RT-PCR检测miR-206-3p与Bdnf mRNA的表达水平,western blot检测BDNF蛋白质表达水平,原位杂交与免疫组化分别检测miR-206-3p与BDNF的组织定位。结果皮肤中miR-206-3p在胚胎期持续升高,到17.5 dpc后逐渐降低,于成年鼠时回复至13.5 dpc时水平;BDNF表达趋势与miR-206-3p相反,而Bdnf mRNA在17.5 dpc至成年鼠并无显著改变。miR-206-3p的分布在皮肤发育过程中逐渐区域化,在出生后主要分布于上基部和毛囊外周,与同期BDNF表达区域毗邻但不重叠。结论 miR-206-3p可能通过转录后调控Bdnf参与了小鼠皮肤神经发育过程。

基于通用质粒标准品的实时荧光定量PCR检测组织因子剪接异构体F3tv1及F3tv2

目的建立基于通用质粒标准品的实时荧光定量PCR(qPCR)法检测人组织因子(TF)两种剪接异构体(F3tv1和F3tv2)。方法设计基因特异性上游引物与通用下游引物,通过引物末端延伸法将2种扩增产物进行序列简并,用于构建通用质粒标准品。用qPCR法检测人白血病细胞株THP-1、Jurkat及外周血单核细胞中F3tv1与F3tv2的表达,分析该法的线性范围与特异性。结果所建qPCR方法对F3tv1与F3tv2扩增特异,线性范围均为108～101copies/μL。THP-1与外周血单核细胞中F3tv1相对表达量分别为(5.70×10-4)±(2.62×10-5)与(1.79×10-4)±(4.37×10-5);F3tv2分别为(4.94×10-5)±(2.19×10-6)与(2.98±2.18)×10-6,Jurkat细胞株F3tv1与F3tv2均未检出。结论建立的qPCR方法可对TF两种剪接异构体同时进行精确、定量地检测,为深入研究TF的选择性剪接调控机制提供实验依据。

过滤去除白细胞时温度对红细胞溶血的影响

目的:探讨在不同温度下过滤去除白细胞时对红细胞溶血的影响,寻找防止其溶血的措施。方法:将保存5d的红细胞悬液40 u随机分为对照组和试验组各20 u,前组红细胞悬液于4℃储血冰箱中取出后立即进行过滤,后组红细胞悬液置于35℃水浴箱复温10 m in再行过滤。测定各组红细胞悬液过滤前后的血浆K+和游离血红蛋白浓度。同时对保存5 d的650 u红细胞悬液(包括4℃立即过滤220 u红细胞悬液和经35℃复温10 m in后过滤430u红细胞悬液)滤后血浆的目测溶血情况进行回顾性分析。结果:对照组红细胞悬液滤后血浆K+、游离血红蛋白浓度分别为(6.41±0.16)mm o l/L、(37.84±6.15)m g/L,比滤前(5.62±0.15)mm o l/L、(23.31±4.24)m g/L明显升高(P<0.05);试验组滤后K+、游离血红蛋白浓度(5.72±0.16 mm o l/L、27.93±5.28 m g/L)与滤前(5.63±0.15 mm o l/L、23.51±4.26 m g/L)比较无显著性差异(P>0.05),但比对照组滤后明显降低(P<0.05)。两组滤前K+、游离血红蛋白浓度均无显著性差异(P>0.05)。4℃立即过滤与经35℃复温后过滤的红细胞悬液其溶血率存在显著性差异(P<0.05)。结论:现用的白细胞滤器能引起一定程度的红细胞溶血,红细胞悬液经35℃复温10m in后再行过滤可有效减少过滤引起的溶血。

肺癌患者血浆中APC基因启动子甲基化定量检测研究

背景与目的:APC基因编码的蛋白参与信号转导途径,大量研究证实APC启动子区的高甲基化在肿瘤的发生发展中起重要作用。本研究建立血浆APC基因实时荧光定量甲基化特异性基因扩增(methylation-specificPCR,MSP)检测方法,并对临床肺癌患者血浆进行检测,以确定该方法在肺癌诊断中的应用价值。方法:将APC基因启动子甲基化阳性肺癌细胞株NCI-H460细胞用有限稀释法获取单个集落形成的细胞,以经典的酚-氯仿法提取细胞DNA,并用MSP对APC基因甲基化进行验证,紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200μL健康人血浆中,得到模拟肺癌患者血浆,利用磁珠核酸提取方法从模拟肺癌及肺癌患者、肺部良性疾病患者和健康对照者血浆中提取DNA,对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰;以模拟血浆样品作为标准品,采用外标准曲线法对各种血浆样品中APC甲基化进行定量分析。结果:所建立的实时荧光定量MSP检测方法的线性范围为1.5×102～1.5×105拷贝/mL,用该方法检测甲基化肿瘤细胞的DNA其最低检测限为1.5×102拷贝/mL。78例肺癌患者有40例组织中检测出APC基因甲基化阳性,其中的19例(47.5%)肺癌患者血浆中APC基因启动子甲基化阳性,APC甲基化浓度为1.67×102～6.78×103拷贝/mL,中位浓度为1.60×103拷贝/mL。38例组织阴性的肺癌患者、31例肺部良性疾病患者和23例健康者的血浆APC基因启动子甲基化均为阴性。结论:实时荧光定量MSP检测血浆APC基因甲基化在肺癌诊断方面具有潜在应用价值。

β_2GPI/抗β_2GPI抗体复合物激活THP-1细胞内TRIF途径

目的:观察β2GPI/抗β2GPI抗体复合物能否激活单核细胞株THP-1的TRIF途径,以探讨TRIF依赖途径在抗磷脂综合征(APS)发病机制中的作用。方法:采用一定剂量β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA及总蛋白,荧光定量PCR(RT-PCR)检测细胞TRIF mRNA水平,Western blot检测细胞TRIF蛋白表达情况;进一步观察TLR4途径抑制剂-TAK-242是否干预β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对TRIF的诱导表达以及相关细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的表达。结果:β2GPI/抗β2GPI抗体复合物(100 mg/L)能够诱导THP-1细胞表达TRIF(mRNA及蛋白),并显示时间效应,分别于刺激1 h和2 h时TRIF mRNA及蛋白表达至高峰。TAK-242(5μmol/L)能够明显抑制β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对THP-1细胞TRIF的诱导表达,同时抑制IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子的表达。结论:TRIF依赖的TLR4途径参与了β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对THP-1细胞的激活,提示其在抗磷脂综合征的病理机制中发挥一定作用。

不同年龄儿童感染肺炎支原体体液免疫的变化分析

目的:通过对不同年龄肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)患儿的体液免疫结果进行分析,探讨肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)感染的发病机制,为MPP患儿体液免疫报告的解读及临床诊治提供参考。方法:352例MPP患儿纳入研究,使用荧光定量PCR检测MPP患儿痰液中的MP-DNA拷贝数,德灵-BN2检测患儿血清IgG、IgA、IgM、C3、C4含量,同时结合细菌培养及病原学9项检测排除其他病原体感染。分析MPP组各年龄段之间及MPP组与对照组之间体液免疫水平的差异。结果:MPP患儿的IgG、IgA、IgM、C3、C4水平均高于对照组(P<0.05),MPP患儿女性C4含量明显低于男性(P<0.05),不同年龄段MPP患儿的IgG、IgA、IgM、C3含量差异有统计学意义(P<0.05),各年龄段MPP患儿体液免疫水平高于对照组。结论:MPP患儿各年龄段体液免疫水平存在差异且均高于对照组,临床在对患儿的体液免疫进行评估时须结合同年龄段儿童的正常参考水平才能正确分析MPP患儿体液免疫状态。

抗β_2GPI/β_2GPI复合物激活THP-1细胞表达炎性相关因子

目的探讨抗β2糖蛋白I(抗β2GPI)自身抗体与β2糖蛋白I(β2GPI)复合物刺激单核细胞株THP-1表达炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α及可能机制。方法用荧光定量PCR法检测抗β2GPI/β2GPI复合物刺激THP-1细胞不同时间(0.5、1、1.5、2、6 h)后IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表达,用免疫荧光染色法及western blot观察THP-1细胞表达IL-6、IL-8、TNF-α蛋白的情况。荧光定量PCR及western blot观察Toll样受体4(TLR4)途径抑制物(TAK-242)干预抗β2GPI/β2GPI复合物对THP-1细胞的刺激作用。结果抗β2GPI/β2GPI复合物(100μg/mL)刺激THP-1细胞不同时间,可使细胞表达IL-6、IL-8及TNF-αmRNA水平逐渐上升,于刺激2 h时IL-6、IL-8及TNF-α达到峰值(P<0.01),免疫荧光染色及western blot证实细胞表达IL-6、IL-8及TNF-α蛋白水平也明显增加。TAK-242(5μmol/L)可显著抑制抗β2GPI/β2GPI复合物诱导的细胞IL-6、IL-8及TNF-α表达。结论抗β2GPI/β2GPI复合物通过TLR4途径,激活THP-1细胞表达炎性细胞因子IL-6、IL-8及TNF-α,参与抗磷脂综合征的病理机制。

实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法。方法以肺癌细胞株NCI-H460作为RASSF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆。用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA。对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测。以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量。结果实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆)。15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%)。5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml。结论实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强。

Ion Torrent PGM^(TM)测序仪检测苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变

目的评价Ion Torrent PGMTM测序仪检测苯丙酮尿症(PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)突变的可行性。方法提取15例确诊为经典型PKU的患儿及其父母外周血DNA,对PAH全部外显子及外显子-内含子交界区进行PCR反应,用Ion Torrent PGMTM测序仪测序,再对检出突变的样本进行Sanger法验证。结果 Ion Torrent PGMTM平均覆盖深度为1 465倍,平均覆盖率为99.3%;共检出29个突变位点,分属17种突变,其中p.P292L为新发突变,所有检测结果均与Sanger法相一致。结论用Ion Torrent PGMTM测序仪可快速简便检测PKU患儿PAH基因突变。

NF-κB在抗β_2GPⅠ/β_2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达组织因子中的作用探讨

目的:探讨核因子κB(NF-κB)在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:使用一定剂量的抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物处理THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞TF mRNA水平,TF活性试剂盒检测TF活性;Western blot检测细胞NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达情况;进一步采用NF-κB抑制剂(PDTC)观察是否能干预抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应,并利用上游信号分子MAPKs的抑制剂观察抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对NF-κB p65磷酸化的影响。结果:抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)能够诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性,与对照相比差异显著(P<0.05);能够增强细胞内NF-κB p65磷酸化(P<0.05 vs media),降低IκB-α水平(P<0.05 vs media);NF-κB抑制剂PDTC(20μmol/L)能够抑制抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞表达TF及NF-κB磷酸化的效应;MAPKs抑制剂均能影响抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞NF-κB p65磷酸化。结论:在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中,NF-κB被激活并发挥重要作用,MAPKs为NF-κB的关键上游分子。

血浆中APC基因甲基化检测在早期肺癌诊断中的应用

目的研究血浆DNA中APC基因启动子甲基化与肺部实体瘤良、恶性的关系,确定血浆中APC基因甲基化检测对早期肺癌诊断的意义。方法以92例CT检查发现肺部实体瘤(直径≤2 cm),并在CT引导下行肺部穿刺患者和23例健康人作为研究对象,收集血浆样本,利用磁珠法提取DNA,行亚硫酸氢盐化学修饰后,采用针对APC基因启动子区的甲基化引物和探针,以荧光定量MSP法(TaqM an探针)检测APC基因的甲基化。结果92例肺部实体瘤患者经病理诊断,有58例确诊为肺癌、31例为肺部良性疾病、3例未明确诊断。58例肺癌患者中有11例(19%)测出APC基因启动子区甲基化阳性,31例肺部良性疾病、3例未明确诊断和23例健康对照组均为阴性。结论检测血浆DNA中APC基因启动子甲基化有助于早期肺癌的诊断。

EGCG干预抗β_2GPI/β_2GPI复合物对THP-1细胞的诱导活化作用

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)干预抗β2GPI/β2GPI复合物诱导人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1细胞)活化的作用。方法用一定剂量的EGCG、脂多糖(LPS)、抗β2GPI/β2GPI复合物等不同刺激物处理THP-1细胞,实时荧光定量PCR检测细胞组织因子(TF)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达;发色底物法检测TF活性;ELISA测定TNF-α蛋白的表达。结果 50 mg/L EGCG能抑制抗β2GPI/β2GPI复合物刺激的THP-1细胞TF mRNA和活性的表达(t值为6.97、3.89,P均<0.05),同时下调该复合物诱导的THP-1细胞TNF-αmRNA和蛋白质的表达水平(t值为3.23、4.65,P均<0.05)。结论 EGCG可干预抗β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞TF及TNF-α的表达,抑制THP-1细胞活化。

葡萄糖对尿液白细胞干化学法测定影响的探讨

目的分析葡萄糖(Glu)对尿液白细胞(WBC)干化学酯酶法(简称干化学法)测定的影响,以提高检测准确率。方法对584例WBC镜检阳性的临床尿液检测资料回顾分析其Glu和WBC干化学结果;选取只有WBC干化学结果分别为±、+、++、+++阳性的新鲜尿液各5份,每份2管(每管10 mL),分为Glu加入组和H2O2加入组,分别对每组样本加入不同浓度Glu和H2O2,并进行干化学测定。在Glu加入组每次测定的同时,用去除Glu模块的试条进行重复测定。结果584例尿检结果中,Glu+++组与Glu++++组的WBC干化学假阴性率均高于Glu阴性组(P=0.001,P=0.000)。WBC干化学阳性检出数随尿Glu浓度的升高而减少[优势比(OR)=0.100,P=0.000],但不受H2O2的影响。结论尿Glu浓度为83.33 mmol/L(15 g/L)时,尿WBC干化学测定已明显受干扰,其受干扰程度随尿Glu浓度的升高而增大,是Glu干扰了尿WBC干化学测定,而非Glu模块的反应产物H2O2。

鲍曼不动杆菌感染与耐药性分析

为了解由鲍曼不动杆菌引起的医院感染情况及其耐药性分析 ,给临床抗感染治疗提供有效帮助 ,应用纸片扩散法检测从临床分离的 117株鲍曼不动杆菌对 11种抗生素的耐药性及其临床感染情况。结果鲍曼不动杆菌的分离主要来源是呼吸道标本 ;该菌对目前使用的多种抗生素耐药 ,存在其复杂的耐药机制 ,对临床常用的11种抗生素耐药率 :头孢噻肟为 87% ,头孢哌酮为 82 % ,头孢唑肟为 85 % ,头孢他啶为 85 % ,头孢吡肟为62 % ,阿米卡星为 67% ,复方新诺明为 10 0 % ,氨曲南为 10 0 % ,哌拉西林为 92 % ,亚胺培南为 3% ,哌拉西林 /舒巴坦为 64%。表明多重耐药的鲍曼不动杆菌已成为医院感染尤其是医院获得性肺炎的重要病原菌 ,加强重症监护病房 (ICU )

116例类风湿性关节炎联合检测4种自身抗体的结果分析

目的 探讨抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体、抗RA54抗体、抗Sa抗体和类风湿因子(RF)联合检测对类风湿性关节炎(RA)的诊断意义。方法 用ELISA法检测抗 CCP抗体,免疫印迹法检测抗 RA54 抗体、抗 Sa 抗体,免疫比浊法检测 RF。结果 抗CCP、抗RA54、抗Sa抗体和 RF对RA诊断的特异性和敏感性分别是95.5%(63/66)和41.4%(55/116),90.9%(60/66)和30.2%(35/116),93.9%(62/66)和36.2%(42/116),80.3%(53/66)和 49.1%(57/116)。在 59例 RF阴性 RA患者中,16 例(27.1%)抗CCP抗体阳性,14例(23.7%)抗RA54抗体阳性,19例(32.2%)抗Sa抗体阳性。4种抗体中任何两种抗体同时阳性的诊断特异性和敏感性分别是98.5%(65/66)和46.6%(54/116)。而当3种或 3种以上抗体阳性时,特异性可达 100%(66/66)。结论 4 种抗体联合检测可显著提高对RA的诊断特异性,有助于早期RA的诊断和治疗。

四种抗体联合检测对早期类风湿性关节炎的诊断意义

目的:探讨抗环瓜氨酸肽抗体、抗RA54抗体、抗Sa抗体和类风湿因子联合检测对早期类风湿性关节炎的 诊断意义。方法:对116例类风湿性关节炎患者,分别用ELISA法检测抗环瓜氨酸肽抗体,免疫印迹法检测抗RA54抗体、 抗Sa抗体,免疫比浊法检测类风湿因子。结果:(1)抗环瓜氨酸肽、抗RA54、抗Sa抗体和类风湿因子对早期类风湿性关节 炎诊断的特异性和敏感性分别是93.9％和41.4％,90.9％和30.2％,92.4％和36.2％,77.3％和49.1％。类风湿因子滴度 至1:128时,与上述3种抗体在特异性上的差异无显著意义。在59例类风湿因子阴性类风湿性关节炎患者中,16例 (27.1％)抗环瓜氨酸肽抗体阳性,14例(23.7％)抗RA54抗体阳性,19例(32.2％)抗Sa抗体阳性。(2)4种抗体中任何两 种抗体同时阳性的诊断特异性和敏感性分别是98.5％和46.6％。而当三种或三种以上抗体阳性时,特异性可达100％。结 论:四种抗体联合检测可明显地提高对早期类风湿性关节炎的诊断特异性,有助于早期类风湿性关节炎的诊断和治疗。

血清褪黑激素与脑卒中预后的相关性研究

目的 :通过测定脑卒中患者血清褪黑激素含量对疾病的预后作初步判断。方法 :测定 5 0例健康人和 62例脑卒中病人 2 :0 0和 8:0 0时的血清褪黑激素质量浓度。结果 :脑卒中患者 2 :0 0时的血清褪黑激素质量浓度比健康人显著降低 (P <0 .0 1) ,8:0 0的血清褪黑激素质量浓度无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;显效组和有效组在治疗前 2 :0 0的血清褪黑激素质量浓度明显高于无效组 ,治疗后显效和有效病人血清褪黑激素水平比治疗前明显升高 (P <0 .0 1)。结论 :血清褪黑激素可作为判断脑卒中预后的一项有效指标。