布氏杆菌S2疫苗株特有基因trbJ的LAMP检测方法建立

为了建立一种快速、准确地检测布氏杆菌S2疫苗株的环介导等温扩增(LAMP)方法,将S2基因组与牛种、羊种野毒株基因组比较,筛选出S2疫苗特有基因trbJ作为检测靶标序列,设计LAMP特异性引物,在对该反应组分、反应条件进行单因素优化的同时,还对该引物特异性、灵敏度、重复性进行测试。结果显示,该方法在65℃等温条件下扩增,反应结束后加入SYBR Green I荧光染料,即可通过肉眼直接观察结果。该方法灵敏性、特异性、重复性良好,能准确鉴别出S2疫苗,与对照菌株无交叉反应。与普通PCR技术相比,LAMP检测灵敏度高100倍,最低可检测出6.89 pg/μL的DNA模板,并且不同批次试剂间的重复性良好。本试验成功建立了一种快速、准确、可视化地检测S2疫苗的LAMP方法。

布鲁氏菌S2疫苗株间接ELISA检测方法的建立

为了区分布鲁氏菌S2疫苗株和布鲁氏菌野毒株,试验通过比对NCBI上公布的布鲁氏菌S2疫苗株和M28野毒株全基因组序列,筛选出S2疫苗株特有基因GL_0002189,对该基因进行克隆、原核表达及蛋白质纯化,以纯化的重组蛋白作为抗原建立间接ELISA检测方法,对该方法的反应条件进行优化后确定判定点,同时对建立的间接ELISA检测方法进行重复性验证、特异性和敏感性试验,并对部分曾接种过布鲁氏菌S2疫苗的83份牛血清进行检测。结果表明:重组蛋白GL_0002189同时以可溶形式和包涵体形式表达,经纯化得到大小为29.2 ku的重组蛋白;在建立的间接ELISA检测方法中,最适重组蛋白包被浓度为2.5 ng/μL,最适血清稀释度为1∶100,最佳酶标二抗稀释度为1∶5 000,判定点为0.586,该方法的特异性为95.0%,敏感性为93.3%,且具有较好的重复性。利用建立的间接ELISA检测方法对83份牛血清进行检测,检出率为7.2%。说明试验建立的间接ELISA检测方法可区分布鲁氏菌S2疫苗免疫牛血清和布鲁氏菌野毒感染牛血清。

捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药株和敏感株转录组水平下差异基因分析

首先筛选捻转血矛线虫丙硫咪唑敏感株和耐药株单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)信息,然后从比较转录组测序数据中筛选出4个丙硫咪唑耐药相关突变基因HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650,并进行生物信息学分析,最后对差异基因进行PCR扩增并测序。结果显示,共筛选到41个具有SNP位点的基因,选择reads≥10的4个基因进行后续基因扩增和生物信息学分析。扩增后目的条带大小均正确,测序后显示HCON_00192020基因在3个耐药虫株中第266位均由T突变为C,HCON_00037800基因在3个耐药虫株中第179、182、188位均由A突变为G,HCON_00129090基因在3个耐药虫株中第283位由G突变为A,HCON00178650基因在3个耐药虫株中第89位均由C突变为A,突变结果均与转录组测序结果一致。