超表达HnCYP82M3和DsTRI基因对颠茄托品烷生物碱合成的影响

托品烷生物碱(TAs)是一类临床上广泛应用的抗胆碱药物,颠茄是提取TAs的主要药源植物,利用代谢工程技术大量获取TAs具有重要的产业价值。本研究基于开源引流代谢工程策略,在颠茄发根中超表达TAs合成途径分支处的细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase,CYP82M3)HnCYP82M3(来源于天仙子)和托品酮还原酶I(tropinone reductase I,TRI)DsTRI(来源于曼陀罗)两个酶基因,以期通过CYP82M3催化合成托品酮(开源),TRI进而将托品酮引入TAs合成的代谢方向(引流),大量促进3种TAs的积累。从天仙子根中克隆了HnCYP82M3基因,其编码氨基酸与颠茄AbCYP82M3序列一致性高达91.7%。单独超表达HnCYP82M3不影响颠茄发根TAs的含量,说明CYP82M3不是TAs合成的关键酶。同时超表达HnCYP82M3和DsTRI极大促进了3种TAs的积累,莨菪碱、山莨菪和东莨菪碱含量分别是对照的4.97倍、2.83倍和2.19倍,并且提高幅度大于DsTRI单表达。本研究证明分支点处酶基因共表达的开源引流策略是有效提高颠茄TAs合成的代谢工程新方法,为工业化大量获取TAs奠定了理论和技术基础。

rolB基因对颠茄表型发育和托品烷生物碱合成的影响

发根农杆菌pRiA4质粒上的rol基因是促进次生代谢的强效基因,可利用rol基因对颠茄进行分子育种以提升颠茄中托品烷生物碱(tropane alkaloids, TAs)含量。本研究将rolB基因在颠茄植株中进行超表达,为了研究rolB基因对颠茄TAs生物合成的影响,分析了转基因颠茄的表型、TAs含量及TAs合成途径中关键酶基因的表达水平。结果表明,转基因颠茄根系发达,叶片增大、叶片鲜重增加、叶片颜色加深,花朵增大、花形改变,雌蕊高度降低,花粉活力下降。转基因颠茄茎中TAs的含量显著高于对照,东莨菪碱、山莨菪碱、莨菪碱的含量分别为对照的2.11~2.91、1.23~2.37、4.88~5.20倍。与对照组相比, TAs合成途径中的关键酶基因N-甲基腐胺转移酶(PMT)、吡咯烷聚酮合酶(PYKS)、托品酮还原酶I (TRI)、芳香族氨基酸氨基转移酶4 (ArAT4)、UDP-糖基转移酶1 (UGT1)和莨菪碱6-β-羟化酶(H6H)的表达上调,且托品酮还原酶II (TRII)作为代谢分流基因表达下调。研究表明rolB基因通过增强TAs合成途径代谢流和减弱竞争支路代谢分流,增强了颠茄根中TAs的合成能力和茎中的积累。本研究为利用rolB基因进行高产TAs颠茄的分子育种奠定了基础。