基于pH下降速率的反馈补料策略高密度培养保加利亚乳杆菌NQ2508

保加利亚乳杆菌是酸奶发酵剂和益生菌制剂的重要菌种,其高密度培养对于提高菌种在应用产品生产中的效率具有重要的现实意义。葡萄糖浓度和发酵pH是影响保加利亚乳杆菌生长的关键因子,底物葡萄糖被转化为细胞菌体和主要代谢产物乳酸,探究葡萄糖消耗速率与表征乳酸生成的发酵pH下降速率的关系,是研究保加利亚乳杆菌代谢流方向的重要方法。该实验通过培养基组成和培养条件对保加利亚乳杆菌生长的影响进行研究,同时对葡萄糖消耗速率-pH降低速率相关模型研究,并基于底物质量守恒定律建立了一条基于pH下降速率的保加利亚乳杆菌高密度培养的反馈补料发酵策略。通过化学中和法控制发酵pH为6.0~5.0,基于pH下降速率进行反馈补料将葡萄糖质量浓度控制在8~2 g/L,发酵液的活菌数达到3.6×10^(9)CFU/mL,是批次分批培养的2.4倍。该策略的应用结果为提高保加利亚乳杆菌的工业化生产效率提供参考。

固定化细胞生物催化制备(S)-苯基乙二醇的研究

采用海藻酸钙固定化细胞方法能有效提高近平滑假丝酵母催化(RS)-苯基乙二醇(S-PED)去消旋化反应的稳定性,在优化反应条件下,固定化细胞催化批次由游离细胞的2次提高至6次,产物可保持高光学纯度(>95%)、高产率(>85%)。与化学合成液晶掺杂剂S-1011的理化特性对比结果表明,生物催化法制备获得的(S)-PED能够替代化学法制备的相同产品。

酶促生物转化丙酮酸生产的研究

建立了一种利用琥珀酰亚胺代谢从延胡索酸生产丙酮酸的新工艺。经诱变得到恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida 15 16 0 )的缬氨酸或 (与 )亮氨酸营养缺陷型变异株M 2 9,该菌株在最优条件下作用 72h将 1mol L延胡索酸转化成为 82 1mmol

近平滑假丝酵母催化立体异构反应中试放大研究

近平滑假丝酵母催化立体异构反应制备光学纯手性芳基醇立体选择性和转化效率高,具有良好工业化放大价值。本研究以Candida parapsilosis CCTCC M203011催化外消旋苯基乙二醇立体异构反应制备(S)-苯基乙二醇为对象考察中试规模下生物催化剂制备和生物转化反应过程。研究发现,按照等通风量和等搅拌桨末端速度为基准进行生物催化剂制备规模放大后,菌体浓度提高至65 g/L,但发酵终了pH下降为2.7,异常产酸,并丧失催化特性。在发酵产酸分析基础上,运用发酵培养基组成、恒pH发酵、发酵溶氧控制等策略,在最优条件下,实现了150 L罐催化剂的高效制备,并成功实现50 L反应釜的转化放大,产物(S)-苯基乙二醇e.e.>99.4%,产率>95.2%。

红曲色素的色调及发酵工艺条件对色调的影响

用扫描式分光光度计对 3种纯红曲色素及板层析分离的色素进行分析 ,得出了其特征性吸收峰及对应波长。安卡红曲黄素 (黄色 ) ,红曲玉红素 (橙色 )分别在 388nm ,464nm ,而红斑玉红胺 (紫色 )在 51 6nm和 41 8nm 2处有吸收峰。复合色素的主吸收峰在 490～ 50 0nm处。此外 ,板层析上还有深黄和米黄等色素。红曲米的色调取决于多种色素的相对比例。红曲米的发酵工艺条件对色素的相对比例具有重要的影响。锌离子对红曲霉产色素具有促进作用。培养过程中添加醋酸不利红曲霉产生橙色素 ,而有利黄色素的产生。

一种新的高立体选择性羰基还原酶的性质及分离

从近平滑假丝酵母(CandidaparapsilosisCCTCC203011)中分离得到了新的NADPH依赖型羰基还原酶。粗酶经硫铵分级沉淀、DEAESepharose离子交换层析、Phenyl-sepharoseFF疏水层析、BlueSepharoseFF亲和层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的相对分子质量为30kD。该酶还原反应的最适pH值为4.5,最适温度为35℃,Cu2+对羰基还原酶有强烈的抑制作用。该酶具有较高的底物专一性和立体选择性,对α-羟基苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯具有较高的不对称还原活力,其产物分别为(S)-苯基乙二醇和(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯,e.e值分别为100%和94.3%。因此该酶蛋白是不对称合成手性醇有效的生物催化剂之一。经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中一个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与假定蛋白(hypotheticalproteinCaO19.10414)具有一定的同源性。

膨化技术及其在酿酒工业中的应用

谷物在膨化过程中 ,其营养成份发生了很大的变化 ,淀粉发生糊化、降解等作用 ,还原糖、糊精含量增高。蛋白质变性、降解 ,胨、氨基酸、缩氨酸等物质有所增加。脂肪分解 ,转化。这些都有利于微生物发酵利用 。

木糖辅助底物对近平滑假丝酵母催化(R,S)-苯基乙二醇不对称氧化还原合成(S)-苯基乙二醇体系稳定性的促进作用

通过分析近平滑假丝酵母Candida parapsilosis催化外消旋苯基乙二醇（PED）不对称氧化还原合成（S）-苯基乙二醇的反应过程,结合微生物中糖类的代谢路径研究,建立了一种以木糖为辅助底物的NADPH辅酶再生的方法,提高了该催化系统的稳定性.结果表明,相同条件下反应体系中添加8 g/L的木糖可使（S）-PED产物的对映体过量值（ee）和产率分别提高14%和10%;菌体可重复使用3-4次,而产物ee值保持在98%.考察了木糖对表达羰基还原酶重组大肠杆菌体系催化效果的影响,发现木糖是通过强化（S）-羰基还原酶的催化作用提高了催化系统的稳定性,其原因是在磷酸戊糖途径中再生了氧化还原反应所需的NADPH辅酶.

近平滑假丝酵母NAD(H)依赖型次级醇脱氢酶的分离纯化及酶学性质

从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC 203011)中分离得到了NAD(H)依赖型的次级醇脱氢酶.粗酶经乙醇沉淀、Blue Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE Sepharose离子交换层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的亚基分子量(Mr)为37.5×103.该酶还原反应的最适pH为6.0,最适温度为45℃,是一个含Zn2+金属酶.该脱氢酶具有较高的底物的选择性,对2-酮具有较高的还原活力;同时,也能作用于醇类发生氧化反应,对次级醇的氧化活力最高.以β-羟基苯乙酮为底物,用纯化得到的酶催化反应后,还原产物为(R)-苯基乙二醇,因此该酶为(R)-专一性次级醇脱氢酶,是一种生产(R)-苯基乙二醇的有效的生物催化剂.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中3个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与NCBI编号为BAA24528的次级醇脱氢酶具有较高的同源性.

加强辅酶循环再生实现不对称合成(S)-1-苯基-1,2-乙二醇

以β-羟基苯乙酮为底物,利用羰基还原酶不对称合成(S)-1-苯基-1,2-乙二醇(PED)过程中,葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化NADPH再生反应与还原反应形成耦联,合成(S)-PED的浓度分别达到0.78 g.L-1和0.75 g.L-1,对映体过量值(e.e.%)分别为91.84%和63.96%;连续分批还原反应后其总转化数(TTN)为26和58;经硫酸铵盐析、离子交换层析DEAE Sepharose、苯基疏水层析Phenyl Sepharose和亲和层析Blue Sepharose后得到电泳纯的羰基还原酶,比活为99.9 U/mg,亚基分子量为29,800;纯酶耦联葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶合成(S)-PED的浓度达到了1.04 g.L-1和1.19 g.L-1,证明了辅酶循环再生的存在.同时发现在利用胞内酶自耦联再生NADPH过程中,以乙醇作为辅助底物时效果最好.

克氏梭菌和酿酒酵母混合培养提高己酸产量

为了提高克氏梭菌8022产己酸的能力,缩短发酵周期,作者将该株菌与酿酒酵母进行了混合培养,并进一步分析混合培养体系提高己酸产量的机理。研究表明:在用发酵罐对己酸菌进行纯培养时己酸菌产量可达6.35 g/L,与酿酒酵母共培养时,产酸达到7.09 g/L,产酸提高了12.5%,且到达最大产酸的周期缩短了约48 h。相关参数的分析表明,酿酒酵母在共培养过程中主要通过提高乙酸到丁酸的转化速率,从而提高己酸的产量。通过分析溶氧值和微生物生长参数,表明引起这一变化的主要原因是共培养时酿酒酵母的生长提高了共培养体系的厌氧水平,促进丁酸的生成和转化,从而提高了己酸的产量。

新型异亮氨酸双加氧酶及其重组大肠杆菌合成羟基异亮氨酸

异亮氨酸双加氧酶(IDO)可特异性的转化底物L-异亮氨酸(L-Ile)生成4-羟基-L-异亮氨酸(4-HIL),该产物具有促进胰岛素分泌的功能,可用于抗糖尿病、降胆固醇等。本研究结合了酶标显色和薄层层析(TLC)的方法从自然界中筛到了具有IDO活性的菌株,并将该菌株中的目的基因ido克隆到大肠杆菌中,获得重组表达菌株,并且验证该菌具有IDO的转化功能。本研究优化了转化反应体系和条件,同时通过30℃过夜温育菌体细胞的方法,使该菌株全细胞转化合成4-HIL的产率达到85%以上。

生物法转化分离耦合制备γ-癸内酯

研究通过添加树脂AB-8吸附转化产物以降低高浓度产物对Yarrowia lypolitica细胞的毒性,进而提高产量。确定了蓖麻油添加量25 g/L、树脂量7.5%、pH值7.5的最佳优化工艺,产物的最大比生成速率提高36%且达到最大值后降低较慢,有利于产物积累,56 h后总产量达到2.17 g/L,耦合工艺在提高产量的同时又能较好地实现产物的分离。

采用复合保护剂提高重组普鲁兰酶稳定性

通过向重组普鲁兰酶(PUL)酶液中添加保护剂和防腐剂以提高其热稳定性及储存稳定性,在不同温度下研究了复合保护剂对酶液的热稳定性影响,并研究了保护剂和防腐剂在常温保藏下对酶液贮存稳定性的影响。结果表明,明胶、甘油、Tween20和Ca2+四种保护剂能显著提高PUL的热稳定性,并通过正交试验得到了效果最佳的复合保护剂配方,即Tween20 2 m L/L,明胶6 g/L,甘油5%,Ca2+0.1 mol/L。在60℃下,添加复合保护剂的PUL酶液保温1 h后的酶活保留率为96.07%,较对照高出85.29%;在55℃,通过添加复合保护剂,半衰期较对照提高了3.27倍。最终在常温保藏90 d后,含有复合保护剂和防腐剂(1 g/L山梨酸钾和1 g/L苯甲酸钠)的PUL酶活保留率高达85.25%,达到了工业保藏的需求。

树脂原位吸附促进高浓度底物不对称氧化还原合成(S)-苯基乙二醇

以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)全细胞为催化剂,考察了添加吸附树脂对不对称氧化还原外消旋苯基乙二醇制备(S)-苯基乙二醇(S-PED)的影响。通过树脂吸附性能考察,筛选出一种对底物有较快吸附速率和较大吸附量的树脂NKAⅡ,在反应体系中加入一定量NKAⅡ树脂,可以显著降低底物和产物对反应过程的抑制,提高反应的初始底物浓度。结合树脂对底物的吸附量和菌体反应的最适底物浓度,建立了树脂添加量随底物浓度变化的关系式,通过此公式添加树脂将溶液中底物产物总浓度控制在最适水平,从而实现高初始浓度底物、快速度反应。在40 g/L初始底物浓度转化体系中加入0.74 g树脂,平衡2 h后,反应108 h,产物S-PED的ee值和产率分别为98.1%和88.5%,产物浓度达到35.4 g/L。

醇类物质诱导培养改善近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)去消旋转化能力

采用近平滑假丝酵母Candidaparapsilosis全细胞去消旋转化外消旋苯基乙二醇(PED)制备S-苯基乙二醇.主要研究了在菌体培养阶段添加底物醇类和酮类对菌体生长及菌体产酶的影响.研究发现添加乙醇可以促进细胞生长,提高细胞中脱氢酶活力,从而改善菌体立体选择性转化能力.通过在菌体培养至对数生长期时添加0.1%乙醇,菌体量增长10%,相对酶活提高30%,采用相同浓度菌体转化105mmol/L(R,S)-苯基乙二醇时,产物(S)-苯基乙二醇的对映过量值从90%提高至99%,产率从87.3%提高至92.4%.

产普鲁兰酶重组大肠杆菌质粒稳定性的研究

通过对产普鲁兰酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-s-pul菌株在发酵过程中质粒稳定性和普鲁兰酶生成量的考察,发现不同宿主对质粒稳定性及酶活性有重要影响。本文利用E.coli BL21(DE3)p Lys S菌株为宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)p Lys S/p ET28a-s-pul,通过控制外源蛋白的本底表达,提高了重组菌株的质粒稳定性。优化发酵培养基和发酵条件以后,重组菌产普鲁兰酶能力由480 U/m L提高至627 U/m L,增幅为30.6%。研究结果认为,严格控制外源蛋白的本底表达,是改善重组菌稳定性的重要方法之一。

氧化还原酶共表达耦联催化合成(R)-4-甲氧基-1-苯乙醇

针对生物催化不对称还原反应中必需辅酶再生及反应效率问题,以抗过敏药物的重要中间体化合物光学活性4-甲氧基-1-苯乙醇为目标产物,构建了羰基还原酶基因SCRII-A220D和葡萄糖脱氢酶基因gdh共表达的重组菌株E.coli BL21/p ET-SCRII-A220D-SD-AS-gdh。该双酶共表达耦联系统中,羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶酶活水平相当,有利于双酶耦联催化反应的进行。通过考察反应体系和环境条件对该共表达耦联系统催化反应的影响,发现底物质量浓度、细胞质量浓度,及反应体系温度和p H值等条件对最终产物合成效率的影响规律。在较优条件下,产物(R)-4-甲氧基-1-苯乙醇的光学纯度达到98%,产率达到82%。

新型醛酮还原酶不对称转化制备(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺

生物催化具有反应条件温和、绿色环保、高立体选择性等优点,已成为制备光学活性度洛西汀的重要方式和途径,但仍存在有效的生物催化剂数量有限和反应效率低等问题,基因组数据库的发展为新型立体选择性生物催化剂的开发提供了有效的途径和平台。本研究通过基因组信息挖掘,从Candida parapsilosis CCTCCM203011中发现了8个新型的醛酮还原酶,分析研究不同的醛酮还原酶对N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)的催化还原能力,发现CPAR4能够高立体选择性地催化还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)。通过粗酶体系反应参数的优化,CPAR4催化还原底物浓度在3g/L时,产率达到94.5%,光学纯度大于99.9%ee;当底物浓度为5g/L时,产率仍达到70%以上。该重组菌粗酶液能够高立体选择性地生物还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP,具有一定的应用潜力。

重组大肠杆菌产普鲁兰酶发酵条件优化

在7L发酵罐规模，利用自诱导培养方式，对重组大肠杆菌产普鲁兰酶发酵条件进行优化研究，主要考察了发酵过程中控制溶解氧浓度、pH和采用补料策略对菌体生长和普鲁兰酶表达的影响。结果表明，最佳发酵培养条件：溶氧浓度维持在20％-30％；pH保持在7．60；第9h时，以0．8g／（L·h）的速度流加甘油；在20h，以0．2g／（L·h）的速度流加乳糖。此条件下，重组菌的细胞浓度OD600nm从12．58上升到42．25，提高了3．36倍；普鲁兰酶酶活力从356U／ml上升到1200U／ml，提高了3．37倍。