定点突变去除抗乙酰胆碱受体抗体的补体结合功能

[目的]制备无补体结合功能的免疫球蛋白样抗乙酰胆碱受体抗体,用于重症肌无力的特异性免疫治疗.[方法]应用定点突变技术,将致病性抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637的重链CH 2区的第322位氨基酸进行K 322 A突变,获得的突变型抗体IgG 637/K 322 A基因经转化大肠杆菌XL 1-Blue进行增殖,测定序列证实为突变序列,转染哺乳类细胞CHO-k 1进行表达,其产物经酶联免疫吸附试验检测与补体C 1 q的结合活性.[结果]突变型抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637/K 322 A不能与补体C 1 q结合,而对照抗体IgG 637可与补体结合.[结论]经定点突变,成功地获得了失去补体结合功能的抗乙酰胆碱受体抗体.

重症肌无力单链抗体A7基因在毕赤酵母中的表达

[目的]将抗乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv)A 7基因转化至毕赤酵母GS 115,筛选阳性转化子并诱导蛋白表达,制备单链抗体A 7蛋白.[方法]将构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组真核表达载体pPIC 9 K-ScFv A 7经SalⅠ酶切线性化后,利用电转化方法转化受体毕赤酵母菌GS 115,以甲醇诱导蛋白表达,应用鼠抗c-myc单克隆抗体进行斑点杂交试验,检查所表达的单链抗体A 7蛋白.[结果]在酵母菌的培养上清液中发现单链抗体A 7蛋白的表达,而阴性对照菌中未见表达产物.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7蛋白已成功地在真核表达系统中表达.

抗乙酰胆碱受体单链抗体酵母表达的特性鉴定

[目的]探讨毕赤酵母GS115表达的重症肌无力单链抗体A7的一般特性及与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的结合特异性.[方法]采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹试验,检测已经转化至毕赤酵母GS115中的重症肌无力重组载体pPIC9K-ScFvA7表达的单链抗体A7蛋白的分子质量;应用间接免疫荧光技术确定表达蛋白与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的亲和性.[结果]毕赤酵母GS115培养上清液中有目的蛋白的表达,分子质量约为44ku;间接免疫荧光试验显示,在大鼠肋间肌细胞间有荧光出现.[结论]单链抗体A7可以在毕赤酵母中成功地表达,并且可与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体结合.

单链抗体A7基因真核表达载体的构建

[目的]构建抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体,为单链抗体A 7基因的真核表达及基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]应用PCR技术,从已构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2单链抗体A 7上扩增单链抗体A 7基因并纯化,将纯化后的PCR产物经EcoRⅠ和AvrⅡ双酶切后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化,再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC 9 K连接,将其产物转化至大肠杆菌DH 5α后扩增,再用AvrⅡ和EcoRⅠ酶切和测定序列检查ScFv A 7基因插入的准确性.[结果]构建pPIC 9 K-ScFv A 7重组载体,经序列测定检查核苷酸序列正确,且ScFv A 7基因准确地克隆至载体开放读码框架内.[结论]成功地构建了抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体.

单链抗体融合人血白蛋白对重症肌无力患者血清与乙酰胆碱受体结合的抑制

目的:研究抗人乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体(ScFv637)融合人血白蛋白(HSA-ScFv637)在体外对重症肌无力(MG)的治疗作用。方法:构建出HSA-ScFv637基因,利用甲醇诱导表达出HSA-ScFv637蛋白,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹试验分析融合蛋白的分子量及特异性;应用竞争性ELISA测定法对HSA-ScFv637抑制MG患者血清与人AChR结合率及表达产物稳定性进行测定。结果:HSA-ScFv637对MG患者血清与人AChR结合的抑制率最高可达77.4%,对AChR的这种保护能力可持续3天,随着样品的衰变HSA-ScFv637保护作用减弱至消失。结论:HSA-ScFv637在体外能抑制MG患者血清与AChR的结合,对AChR具有保护作用。