基于蛋白质保留膨胀显微镜对微囊泡进行荧光成像的实验研究

目的:探讨蛋白质保留膨胀显微镜(proExM)与小鼠下颌骨来源微囊泡(MVs)的相容性,观察膨胀后MVs表面标志物的分布情况并精确识别其细胞来源。方法:采用差速离心法分离小鼠下颌骨来源MVs;利用透射电子显微镜、Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术对MVs进行观察鉴定;对MVs表面蛋白CD9、CD63、碱性磷酸酶(ALP)、破骨细胞相关受体(OSCAR)进行免疫荧光染色;采用proExM技术对免疫荧光染色后的MVs进行膨胀放大;测量膨胀系数并利用激光共聚焦显微镜观察膨胀前后MVs的形态以及荧光染色情况。结果:差速离心法分离得到的小鼠下颌骨来源MVs符合MVs鉴定标准;在该实验流程下,通过凝胶的膨胀实现小鼠下颌骨来源MVs的4倍膨胀;膨胀后MVs线剖面上CD9、CD63的荧光强度分布呈现多峰;相较于膨胀前,膨胀后MVs表面标志物CD9、CD63的曼德斯共定位系数(MCC)1方差变大(P<0.01),MCC2方差变小(P<0.05),皮尔森相关系数(PCC)方差变大(P<0.01);膨胀后实现对成骨细胞分泌的MVs以及破骨细胞分泌的MVs的精准识别;膨胀后测得小鼠下颌骨来源CD9+MVs中,成骨细胞来源MVs占比11.11%,破骨细胞来源MVs占比3.70%。结论:该实验流程可在小鼠下颌骨来源MVs的观测中提高分辨率,为揭示MVs表面蛋白分布的异质性,精准识别组织MVs的细胞来源建立一种标准实验流程。