高通量测序分析不同地区红腐乳细菌多样性

为了解我国传统发酵食品红腐乳中细菌的多样性及其微生物安全性,采用高通量测序技术,分析华东、华北和东北地区红腐乳中细菌16S rDNA V1-V3区基因序列,比较不同地区红腐乳中微生物群落结构组成及多样性差异。结果显示,本次测序深度有效地覆盖了样品中微生物种类,不同地区红腐乳样品中细菌群落结构具有丰富多样性。在门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)为不同地区红腐乳种主要优势菌的门;而在属水平上,9个红腐乳样品共检测出296个细菌属,其中共有菌属分别为:棒状杆菌属(Corynebacterium)、四联球菌属(Tetragenococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、Rummeliibacillus属、乳球菌属(Lactococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、链球菌属(Streptococcus)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)以及Trabulsiella属。不同样品中菌群的结构与地区存在一定的聚类关系:明串珠菌属、乳球菌属以及四联球菌属是华北地区样品中主要的优势菌属,而东北地区腐乳样品中的芽孢杆菌属和盐厌氧菌属为主要优势菌属。研究结果加深了对红腐乳中细菌群落组成和多样性的认识,为保证传统发酵食品的质量安全、生产工艺提供一定的理论支持。

微生物法测定发酵食品中维生素B12含量的研究

为明确发酵食品中维生素B12的含量及分布,利用微生物法对大豆发酵食品(3种类型腐乳、韩国大酱、纳豆、豆汁)及奶酪中维生素B12的含量进行了测定。结果表明,在3种腐乳中,臭腐乳维生素B12含量最高,达到(3.57±1.08)μg/100 g,红腐乳和白腐乳分别为(0.48±0.21)μg/100 g和(0.41±0.16)μg/100 g;除腐乳外,纳豆(0.50 μg/100 g、0.20 μg/100 g)、韩国大酱(0.97 μg/100 g、0.10 μg/100 g)、豆汁(熟)(0.52 μg/100 g)的维生素B12含量均低于臭腐乳。虽然个别奶酪样品中维生素B12含量最高可达1.54 μg/100 g,但其总体维生素B12的分布及含量也均低于臭腐乳。

深度测序技术检测益生菌产品菌株组成及16SrDNA序列

目的:探查益生菌制品的标签标示与产品中实际检测到的菌株比较及不同产品中菌株的异同性。方法:以市场上购买的进口、出口酸乳制品作为研究对象,设计可区别24种产品的样品标签序列(Barcode),通过PCR及Illumina平台深度测序分析,获得了酸乳制品中所含益生菌种类及序列等详细信息,根据Barcode序列信息对其中所含的24个混合样本进行区分,然后利用16S RDP的16S数据库,对测序的Reads进行比对。结果:24种产品中标签标示与样品中实际检测到的菌株完全一致的仅有两种,在24种酸乳制品中,以嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌/德式乳杆菌为主要发酵菌株,双歧杆菌作为添加的益生菌基本在所有样品中存在,但含量较低,另一方面,不同产品中同一菌株的16S rDNA序列相似度较高,仅有两种菌株的1～2个碱基存在差异。结论:深度测序是一种可快速有效对食品中微生物群体精确筛查的技术,能够精确深入了解食品中微生物群落。使用溶方法检测目前市场上的酸乳制品,可发现使用的发酵菌种多来自商业化购买的菌剂,同质化程度较高,而作为后添加的双歧杆菌由于其生长条件的苛刻,实际活菌数量较低。

转录组测序深度对表达基因检出及表达量估计的影响

基于第二代测序技术的转录组测序(RNA-seq)是目前基因表达分析的重要手段,其测序深度与检出的表达基因数量及基因表达量准确程度直接相关。为探索转录组测序深度对基因表达分析的影响,进而为不同实验需求选择合适的测序深度提供参考,本研究采用Hiseq2000高通量测序平台完成小鼠大脑转录组的深度测序,共产出38 M有效reads。从中随机抽取总量的25%,50%,75%和全部数据模拟建成4个不同测序深度的文库,并以相对表达量RPKM值的高低将表达基因划分为5组,比较分析不同测序深度下不同组别检出表达基因个数以及基因相对表达量(RPKM)的变化。结果表明,9.5 M reads的测序深度中可检出81.55%的总编码基因,而随测序深度增加新检出表达基因的数量逐步减少。基因表达量的分析中,中高表达量基因RPKM[30,+∞)、偏低表达基因RPKM[3,30)和低表达基因RPKM[1,3)的相对表达量分别在9.5 M,19 M和28.5 M有效reads的测序深度以上的文库中趋于稳定。由此可知,研究中高表达基因时,可参考的转录组测序量为9.5 M有效reads以上,而研究低表达基因时,测序量需为19 M有效reads或更高。

液态活检在非小细胞肺癌中的应用及对中医肺癌研究的启示

肺癌是全球癌症发病率和死亡率最高的疾病之一，其中非小细胞肺癌占83％。NSCI．C以肿瘤组织的病理学诊断为金指标，可用于组织学分型、分子病理诊断、预后判断与治疗方案选择。然而由于肿瘤的异质性和进化，

空肠弯曲菌活而不可培养状态的产毒素能力及毒素基因表达的检测

目的通过诱导空肠弯曲菌进入活的不可培养(VBNC)状态建立细胞学模型,用VeroE6细胞和HeLa细胞检测空肠弯曲菌产细胞膨胀性肠毒素(cytotoxic distendingtoxin,CDT)能力的改变,并在RNA水平上进一步验证毒素的表达。方法采用4℃冷藏及-70℃冷冻的方法诱导空肠弯曲菌进入VBNC状态,利用细胞总数计算、活细胞染色计数及可培养细胞计数间接确证VBNC状态细菌的存在,细胞对于VBNC状态下的细菌仍然敏感,并用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实空肠弯曲菌毒素基因的表达。结果3种不同状态的细胞计数结果表明存活细胞进入了VBNC状态,细菌经4℃冷藏及-70℃冷冻后数量减少约1个数量级,在冷冻前,细菌对细胞毒性较强,72h时70%以上细胞凋亡,冷冻后的VBNC状态细菌对VeroE6和HeLa细胞的生长仍有影响,72h时约有40%细胞进入凋亡状态。结论低温、贫养条件下空肠弯曲菌可进入VBNC状态,用常规传统的羊血平板培养基仅能使不到10%的空肠弯曲菌复苏生长,从而可以检测,在VBNC状态时,空肠弯曲菌产毒素能力改变较大,远远低于正常状态,但仍具备产毒素的能力,也从RNA水平实验得到证实。

microRNA-196a2 T>C基因多态性与中国汉族人群肝硬化发生的相关性

目的探讨microRNA-196a2 T>C基因多态性与肝硬化发生的相关性。方法采用聚合酶链反应和连接酶检测反应法(PCR-LDR)检测110例肝硬化患者及391例健康对照者microRNA-196a2 T>C基因多态性,运用SPSS 10.0软件对结果进行统计学分析,并分别对男性及女性个体microRNA-196a2 T>C基因多态性进行分析。结果肝硬化组与对照组都是以CT基因型为主,CC基因型及等位基因C在肝硬化组的分布频率(0.191,0.423)低于健康对照组(0.235,0.487),但无统计学差异(P>0.05);该位点基因型及等位基因在男性或女性个体中的分布趋势与整体趋势相似,相关差异也无统计学意义(P>0.05)。结论在中国汉族人群中,microRNA-196a2 T>C基因多态性与肝硬化的发生并没有明显相关性。

乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法

目的:为快速准确检测乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌,建立实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)检测方法。方法:根据嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR保守区域设计特异性引物与探针,借助建立的实时荧光定量PCR方法进行特异性、灵敏度、重复性以及抗干扰能力验证,并利用模拟样品对方法进行检验,最后对市售的实际样品进行检测。结果:该方法的特异性较好;方法的绝对灵敏度达到3 pg,相对灵敏度达103 CFU/mL;重复性检测表明相对标准偏差在2.6%以下。同时进行杂菌干扰实验,在纯基因组水平和培养物水平混合大肠杆菌,扩增均无明显影响,表明建立的方法抗干扰能力较好。利用建立的实时荧光定量PCR方法对模拟样品进行检测并建立标准曲线,得出R^2为0.987,线性较好,可进行实际样品的检测。对市售的11份样品进行检测,其中6份含有嗜酸乳杆菌菌株,5份不含嗜酸乳杆菌菌株,标记嗜酸乳杆菌的样品全部检测出嗜酸乳杆菌且含量在5.83×10~2～3.68×1~04 CFU/mL之间。结论:建立的实时荧光定量PCR方法可快速、准确地检测出乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌。

16S rDNA特异性引物设计优化及其在淞江鲈体表微生物鉴定中的应用

引物与模板的结合特异性是PCR反应成功与否的主要决定因素之一.在进行以16srDNA为目标序列的菌种鉴定或者各种检测应用中,对引物的特异性具有较普遍的要求.需扩增出完整的目标属,实现属内保守,同时避免有效扩增其他属的相应序列即实现属间特异.对此,我们对引物设计进行优化,通过分析所有已知细菌16srDNA序列,针对特定目标属筛选特异和最高效的引物对,并在淞江鲈的体表菌群样品中进行验证实验.结果表明,所设计的引物具有较好的属内保守性和特异性,而且引物在扩增中的效率也有一定的保证,能够很好地应用于菌群的定量PCR分析.

人类基因组miRNA转录调控区保守性DNA序列生物信息学分析

MicroRNA(miRNA)的表达调控方式一直是一个有争议的问题,为了研究miRNA潜在的转录调控特点,本文通过Sanger网站miRNA数据库获得人类miRNA的信息,并建立miRNA相关信息数据库,用MEME和Wordspy两个软件对其上游2000bp序列进行保守性分析,得到保守性的DNA序列(motif),用TESS软件分析保守性DNA序列,预测其转录因子结合情况。通过比较位于基因间、反义链和内含子中的三类不同miRNA转录调控区的保守性和自主转录能力的差异,结果发现位于基因间、反义链上的miRNA上游调控区的保守性比位于内含子的miRNA高,在miRNA的转录调控区存在RNA聚合酶Ⅱ类型的转录因子结合位点,miRNA还表现出自身独特的转录调控方式。通过分析,我们还得到了miRNA表达调控中一些重要的转录因子以及独特的调控序列。本研究结果为miRNA转录调控机制的进一步研究提供了理论依据。

基于微滴式数字PCR的饮料中嗜酸乳杆菌定量检测

基于微滴式数字PCR技术(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)建立饮料中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus strains)的检测方法。以嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR区域的重复序列设计并合成的引物,对其进行条件优化、特异性检测、优化反应体系,并对体系的灵敏度、重复性、抗干扰能力进行验证,最后对市售的实际样品进行检测。结果表明该方法的特异性很好;方法的灵敏度达到了0.25 pg/μL;重复性的标准偏差在2.34%~6.1%之间;在抗干扰检测中,实验组与对照组结果一致性好,提示该方法抗干扰能力较好;对市售的11批次样品进行检测,标记含有嗜酸乳杆菌的样品中均检出嗜酸乳杆菌且含量为1.6×10^3~2.3×10^6copies/g。研究建立的ddPCR方法可用于饮料中的嗜酸乳杆菌的快速和精确定量。

不同功效中药对裸鼠肺癌皮下移植瘤及转移相关微小RNA的影响

目的观察益气养阴、健脾温肾、软坚散结中药对裸鼠人肺癌NCI-H460细胞皮下移植瘤的影响及其可能作用机制。方法将人非小细胞肺癌细胞株NCI-H460接种于32只裸鼠皮下,成瘤后随机分为健脾温肾组、益气养阴组、软坚散结组和生理盐水组,每组8只。接种1个月起各组小鼠分别灌胃给予相应药物,健脾温肾方、益气养阴方、软坚散结方药物浓度分别为1.1、1.9、1.8 g/ml,每日1次,每次0.3ml,共15天。检测各组荷瘤小鼠肿瘤体积和重量,计算抑瘤率,PCR检测肺癌皮下移植瘤中MicroRNA-21、MicroRNA-218的表达。结果给药10天时各组小鼠瘤体积均较给药前明显增大,给药15天时益气养阴组、软坚散结组、生理盐水组小鼠瘤体积较给药前增大(P<0.05)。温肾健脾组、益气养阴组、软坚散结组肿瘤抑制率分别为9.9%、16.3%、11.8%,各组抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)。益气养阴组瘤重、MicroRNA-21的表达量均明显低于生理盐水组(P<0.05)。结论益气养阴方可以抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,下调致癌基因相关微小RNA的表达可能是其作用机制之一。

RYR1基因突变所致先天性肌纤维类型不均1例报道及文献复习

目的报道1例RYR1基因突变引起的先天性肌纤维类型不均(CFTD)病例,加强对常染色体隐性遗传的RYR1基因突变相关表型的认识。方法收集1例CFTD患者的临床表现、实验室检查、影像学表现、肌肉病理以及基因检测结果,结合文献复习进行分析讨论。结果患者为年轻女性,自幼出现眼外肌麻痹,体育成绩差。体格检查见脸型狭长、高腭弓等多种先天性体征,肌张力低下,面肌、抬头肌及四肢近端肌肌力差。血肌酸激酶正常。肌电图示肌源性损害。肌肉MRI见半腱肌部分受累。肌肉病理见Ⅰ型纤维相对较小(>12%)。二代测序示RYR1基因复合杂合突变(c.C11314T,p.R3772W/c.A164G,p.Q55R)。Western blot检测示患者RYR1蛋白表达与正常对照比较明显降低。结论本病例系国内首次报道RYR1基因突变引起的CFTD。CFTD属先天性肌病,肌肉活检有助于病理诊断,基因检测对最终诊断以及遗传方式确定具有决定意义。

16S rRNA和MLST在配方乳粉双歧杆菌分类中的应用

婴幼儿配方奶粉是婴幼儿主要的食物来源,其安全性成为人们关注的焦点。试验分别利用基于16S rRNA和基于多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)技术的系统进化分析方法对12株双歧杆菌标准菌株和17株分离自10例益生菌奶粉样品的菌株进行分型鉴定。系统发育分析结果表明,相对于16S rRNA分型技术,基于MLST分型技术的分析方法具有更高的分辨率。

癌症相关基因选择性剪接进化数据库的构建

选择性剪接是真核生物基因调控的基本调节机制之一,与各种类型的生理和病理活动相关.癌症相关基因的不正常剪接可能与多种癌症的发生发展有关.作为选择性剪接进化的主体,选择性剪接外显子展示了其在不同物种中多样的进化功能.本文系统整理了2 989个癌症相关基因的各项功能,通过比较基因组学的分析方法总结了癌症相关基因的选择性剪接外显子的功能和进化关系,建立了癌症相关基因选择性剪接进化数据库(ASeeDB数据库).ASeeDB包含癌症相关基因外显子区域的进化保守性、结构域预测、Ka/Ks值、以及基因、转录本、外显子区域3个层次的表达量统计等信息,结合这些信息用户可以方便的检索有研究意义的基因或者外显子.外显子区域蛋白质结构域的预测可以帮助了解其可能的功能,而外显子是否存在选择性剪接又可以推及包含该外显子的转录本是否具有相似的功能以及推测剪接是否会对蛋白质功能发生影响.数据库提供的物种间的序列比对可以帮助用户发现没有注释的外显子区域或者是保留的失去功能的外显子.相比于基因层面的Ka/Ks,数据库提供的外显子层面的Ka/Ks对于发现适应性进化事件具有更高的敏感性,可以更加方便地预示基因中未知功能的区域.

多位点序列分析在食品用双歧杆菌分类鉴定中的应用

双歧杆菌是一类被广泛应用于食品工业的益生菌,准确、快速地分类和鉴定双歧杆菌对其应用和管理具有重要意义。选择了可在食品中使用的双歧杆菌菌种中的12个代表菌株,使用多位点分析的方法对其16S r DNA和7个管家基因进行研究,从系统发育的角度讨论利用多基因串联的方式对双歧杆菌属建立稳定可靠的分类方法的可行性。研究发现双歧杆菌属中部分菌株存在特异性序列缺失,可以为菌株的快速检测提供线索;多基因系统发育分析较16S r DNA分析方法分辨力更高,可应用于食品中双歧杆菌的分类鉴定。

健脾温肾方对皮下移植瘤术后模型裸鼠肺转移瘤体中miRNAs及相关靶基因mRNA表达的影响

目的探讨健脾温肾方对肺癌术后复发转移的预防作用及可能机制。方法建立NCI-H460-Luci细胞皮下移植瘤术后裸鼠模型,随机分为健脾温肾组、化疗组、对照组,每组16只。健脾温肾组术后第1天开始给予健脾温肾方溶液(1.1 g/ml)0.3 ml/d灌胃,每日1次,干预13周;化疗组给予紫杉醇注射液15 mg/kg,每隔5天腹腔注射1次,共用3次;对照组给予生理盐水0.3 ml/d灌胃,每日1次,干预13周。每周1次至术后13周,采用活体成像观察裸鼠肿瘤转移情况,分析各组术后无瘤转移生存时间;术后第6周,采用实时荧光定量PCR法检测瘤体中miR-18a-5p、miR182-5p、miR21、miR106b-5p及相关靶基因乳腺癌易感基因1(BRCA1)、重组人磷酸酶及张力蛋白同源体(PTEN)、P53肿瘤蛋白(TP53)、表皮生长因子受体(EGFR)mRNA表达量。结果与对照组比较,健脾温肾组、化疗组裸鼠瘤体中miR-18a-5p、miR182-5p表达降低,BRCA1 mRNA表达升高(P<0.05或P<0.01);化疗组裸鼠瘤体中miR21、miR106b-5p表达亦较对照组降低(P<0.05或P<0.01)。各组裸鼠瘤体中EGFR、PTEN、TP53 mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。健脾温肾组和对照组无瘤转移生存时间比较差异具有统计学意义(P<0.05),化疗组与健脾温肾组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论健脾温肾方在预防肺癌术后转移方面有一定作用,其机制可能与调节miRNAs及相关靶基因mRNA有关。

结合多组学和人类蛋白互作网络研究急性髓细胞白血病中的突变基因互作子网络

急性髓细胞白血病(AML)是一类由血液中白细胞恶性增殖引起的恶性疾病,很多与AML致病性相关的基因突变还没有被阐明,使用基于多组学整合分析的方法可以有效地揭示AML中基因突变与疾病间的相互关系.通过使用来源于癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)计划中AML病人的1 450个体细胞突变基因数据和这些基因的RNA表达量数据,结合人类蛋白互作网络,构建了在AML中的基因子网络.发现的基因子网络中包含21个突变基因,KEGG代谢通路和GO富集分析结果表明,趋化因子信号通路和染色体结构相关基因在AML的致病性中具有重要作用;并且,基因子网络可以反映AML中突变基因间的相互作用关系,可以加强对AML致病机理认识.在基因子网络中,部分基因已经被证明与AML相关,如NPM1,KDM1A和NRAS等,但部分基因还需要进一步探索,如CBX7,GNAI2和COPS2等.对这些基因的深入研究可以加强对疾病致病机理的认识.最后提供了整合多组学数据研究疾病的框架,并且该框架可以应用于其他疾病或机制的研究中.

肺癌术后复发转移相关微小RNA的研究进展

近年来,与肺癌复发转移相关微小RNA （miRNA）的临床研究取得了重要进展.在PubMed上检索与非小细胞肺癌（NSCLC）术后复发转移相关的miRNA临床研究文献,结果发现miRNA 在肺癌中具有差异性表达,部分已揭示与术后复发转移预后相关,可以作为今后的治疗靶点.但目前临床研究中发现的与NSCLC术后复发转移相关的miRNA,绝大部分尚处在筛选阶段,缺少大样本的临床验证,尤其是随机、对照研究.