生物角膜用于人角膜板层移植术后的临床疗效及激光扫描共焦显微镜动态观察

背景近年来由于角膜供体材料的缺乏，异种角膜移植研究逐渐受到研究者的关注，猪角膜脱细胞基质构建的生物角膜支架具有良好的生物相容性并已制备成生物角膜材料，但其用于人眼角膜移植后的临床效果及其组织形态学变化特征尚不清楚。目的观察用生物角膜进行人板层角膜移植术后的临床效果，并利用激光扫描共焦显微镜进行活体动态观察，评估生物角膜作为新型角膜替代材料进行人眼角膜板层移植的可行性。方法采用前瞻性系列病例观察研究方法，于2014年2—8月在河南省立眼科医院纳入药物治疗无效的感染性角膜炎或陈旧性角膜白斑患者15例15眼，包括真菌性角膜炎4例，细菌性角膜炎1例，混合感染性角膜炎9例，陈旧性角膜白斑1例。采用猪角膜脱细胞基质构建的生物角膜行患眼生物角膜板层移植术，以术眼的对侧正常眼作为对照。分别于术后3d、7d、1个月、3个月、6个月、9个月和12个月对术眼进行随访，对植片愈合情况进行评分，随访时间为1年。疗效指标主要包括角膜透明度、新生血管形成、角膜植片有无溶解或感染复发、最佳矫正视力（logMAR）。分别于术后3、6、9和12个月利用激光扫描共焦显微镜对角膜进行动态观察，记录和分析移植后角膜上皮和内皮细胞的形态和密度、角膜基质的形态特征以及角膜上皮下神经纤维的恢复情况。结果术眼术后3d早期出现角膜水肿等炎症反应，术后7d炎症反应消退。术后1个月植片透明，随访期间未出现角膜溶解、感染复发现象。术后6个月时1例患者出现青光眼，术后12个月时1例患者发生排斥反应。术眼术前及术后不同时间点间logMAR、角膜透明度评分、角膜新生血管评分的总体比较差异均有统计学意义（X2=92．63、59．37、10．50，均P〈0．05），其中术后视力、角膜透明度均较术前明显改善，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。激光扫描共焦显微镜检查结果显示，术眼术后受体角膜上皮细胞逐渐覆盖植片，完成正常的上皮化，角膜上皮细胞形态接近对侧正常眼，但角膜内皮细胞体积大于对侧眼，而植片角膜基质中无细胞生长，明显与对侧眼角膜基质不同；术后6个月时8例患者植片内有上皮下神经纤维长入，但神经纤维走形弯曲，密度明显低于对侧正常眼。术后不同时间点角膜上皮细胞密度总体比较差异均无统计学意义（F=1．48，P=0．22）。对侧正常眼、术眼术后3、6、9和12个月角膜内皮细胞密度分别为（2542±119）、（1895±129）、（1869±135）、（1854±101）和（1844±103）个／mm2，术眼术后各个时间点角膜内皮细胞密度均明显低于对侧正常眼，差异均有统计学意义（均P〈0．05）；术后6、9和12个月角膜上皮下神经纤维密度值分别为（1．26±0．13）、（3．62±0．81）和（5．98±0．44）mm／mm2，均明显高于前1个时间点的测定值，差异均有统计学意义（t′=-8．16、-7．24，均P=0．00）。结论用生物角膜行人眼角膜板层移植术后植片即可长期存活，重建眼表结构，改善患者视力，可替代人角膜供体材料。

中性粒细胞在不同品系正常小鼠角膜的分布及其与角膜创伤修复的关系

背景 以往人们通常认为角膜无血管、无髓系来源的免疫细胞存在.C57BL/6J小鼠、BALB/c小鼠和裸鼠是眼科免疫学基础研究的常用模型,这些小鼠的角膜是否存在天然免疫的关键细胞——中性粒细胞是值得关注的问题. 目的 研究实验室常用的C57BL/6J鼠、BALB/c鼠和裸鼠正常角膜的中性粒细胞分布特征及其与角膜创伤修复的关系,为相关研究提供依据. 方法 选取角膜正常、10 ～ 12周龄的SPF级雄性C57BL/6J鼠、BALB/c鼠和BALB/c背景的裸鼠各16只,取3种小鼠各8只制备成中央区相连的4瓣角膜铺片,并以角膜周边血管缘为界向内以3个同心圆分区.分别用Gr-1-FITC抗体和CD31/PECAM-1-PE抗体对角膜中性粒细胞和血管进行免疫荧光染色,用免疫荧光显微镜和AR软件测量角膜血管面积并计数中性粒细胞.选取3种小鼠各8只制备角膜创伤模型,用无菌手术刀片以角膜中央为中心做十字划痕,深度至角膜前弹力层.创伤后即刻（0 h）、12h、24 h用2 g/L荧光素钠点眼,荧光显微镜下以AR软件计算不同时间点的创伤面积.于划痕后24 h取小鼠角膜制备铺片,用Gr-1-FITC抗体和CD31/PECAM-1-PE抗体行荧光染色,比较3种创伤小鼠角膜的血管分布、中性粒细胞的数量和分布情况.实验动物的饲养与使用均遵循美国视觉与眼科研究协会制定的科研动物使用规范. 结果 正常C57BL/6J小鼠、BALB/c小鼠和裸鼠角膜中性粒细胞总数分别为（1 733±237）、（353±96）和（1 601 ±223）个/角膜,BALB/c小鼠角膜中性粒细胞数明显少于C57BL/6J小鼠和裸鼠,差异均有统计学意义（P＜0.01）.3种正常小鼠角膜缘均可见血管分布,BALB/c小鼠角膜缘血管面积明显小于C57BL/6J小鼠和裸鼠,C57BL/6J小鼠角膜缘血管面积明显大于裸鼠,差异均有统计学意义（P＜0.01）.3种正常小鼠中性粒细胞的数量与血管面积均呈明显正相关（C57BL/6J：r=0.936,P=0.001;BALB/c：r =0.939,P=0.001;裸鼠：r=0.935,P=0.001）.角膜划痕后24 h,C57BL/6J小鼠和裸鼠的创伤面积均明显大于BALB/c小鼠（均P=0.000）,且以裸鼠的创伤面积最大.角膜划痕后C57BL/6J模型鼠、BALB/c模型鼠和模型裸鼠的角膜上中性粒细胞数目分别为（3 340±417）、（1 235±337）和（4 680±450）个/角膜,BALB/c模型鼠角膜上中性粒细胞数目明显少于C57BL/6J模型鼠和模型裸鼠,差异均有统计学意义（均P=0.000）.3种小鼠角膜创伤面积与中性粒细胞数目均呈明显正相关（C57BL/6J小鼠：r=0.805,P=0.016;BALB/c小鼠：r=0.943,P=0.000;裸鼠：r=0.916,P=0.001）. 结论 不同品系的正常小鼠角膜中性粒细胞分布的数目取决于角膜血管的分布和面积,角膜损伤后小鼠角膜中性粒细胞数目增加,角膜中性粒细胞数目较少的小鼠其角膜创伤修复速度较快,提示角膜血管网部位中性粒细胞的基础状态可能与角膜对感染的易感性以及感染后的早期反应有关.

BALB/c小鼠角膜细胞密度和大小的活体三维测量

背景 角膜细胞的形态学参数及其密度对角膜结构的完整性及其正常功能的维持具有重要意义.目前,BALB/c小鼠已成为角膜研究中广泛应用的实验动物,了解正常角膜细胞的大小、形态及密度可为相应的实验研究提供参考依据. 目的 应用双光子激光扫描显微镜对BALB/c小鼠的不同角膜细胞进行活体扫描,对细胞密度、细胞大小参数进行活体三维测量,活体观察角膜不同细胞的形态学特征.方法 收集6只8 ～13周龄BALB/c小鼠,麻醉后荧光解剖显微镜下于角膜基质内注射20 μg/ml的胞质膜染料1μl,注射后1.5h于注射部位的对侧注射500 μg/ml Hoechst 33342 1 μl,30 min后使用双光子激光扫描荧光显微镜对角膜中央视野（XY轴）的角膜内皮层、基质层和上皮层进行Z轴逐层扫描,每层扫描厚度为2μm,图像像素为512×512,图像位数为12 bit.应用Imaris软件对扫描的图像进行细胞密度以及细胞大小参数的测量,细胞密度通过计算3维空间内细胞核数目获得;通过软件自动测量角膜上皮基底层、中基质层和内皮层细胞和细胞核的表面积和体积,并计算细胞和细胞核的表面积/体积值和细胞的核质比. 结果 BALB/c小鼠角膜上皮基底层和内皮层均为单层细胞,而中基质层包括2层细胞.小鼠角膜上皮基底层细胞密度为（108.00±18.97） ×10^4/mm3,明显大于中基质层的（9.27±0.48）×10^4/mm3和内皮层的（22.30±2.28）×10^4/mm3,3个组间总体比较差异有统计学意义（F=141.592,P=0.000）;以中基质层的细胞表面积和体积最大,其次为内皮层,上皮基底层的细胞表面积和体积最小,3层细胞间的表面积和体积的总体比较差异均有统计学意义（F=2 222.000、598.504,均P=0.000）.小鼠角膜上皮基底层、中基质层和内皮层细胞的表面积/体积值分别为（0.80±0.13）、（0.51±0.07）和（0.40±0.04）/μm,以上皮基底层细胞最大,3层间总体比较差异有统计学意义（F=127.075,P=0.000）.小鼠角膜以内皮层的细胞核表面积和体积最大,其次为中基质层,以上皮基底层细胞的细胞核表面积和体积最小,但以上皮基底层细胞核的表面积/体积值最大,以内皮层细胞核的表面积/体积值最小;小鼠角膜内皮层细胞的核质比明显大于上皮基底层和中基质层细胞. 结论 双光子激光扫描显微镜可对BALB/c小鼠中央角膜3层细胞参数,包括细胞和细胞核表面积及体积进行活体定量测定,为BALB/c小鼠角膜生理、病理和疾病的相关研究提供参考依据.

双醋瑞因在小鼠角膜中的药代动力学行为

目的考察双醋瑞因在小鼠角膜中的药代动力学行为。方法将2%双醋瑞因滴眼液单次滴入小鼠双眼结膜囊,分别于滴眼后5、15、30、45、60、90、120、150、180 min处死动物,取角膜,HPLC法测定角膜中双醋瑞因代谢产物大黄酸含有量。结果各个时间点小鼠角膜中均未检测到双醋瑞因,而是其活性产物大黄酸。给药后5 min,角膜中大黄酸含有量最高,为(143.59±2.37)μg/g,之后逐渐下降。角膜组织中药物浓度半衰期为(0.86±0.06)h,达到最大药物质量浓度所需时间为5 min(0.08 h),最大药物质量浓度为(143.59±19.61)μg/g。结论双醋瑞因滴眼液能够透过角膜上皮到达小鼠角膜,并完全转化为大黄酸,具有良好的药代动力学特征。

硅水凝胶绑带式角膜接触镜对翼状胬肉术后眼表修复的疗效观察

目的探讨硅水凝胶绑带式角膜接触镜对翼状胬肉术后眼表修复的疗效。方法回顾性分析2016年8月至2017年8月于复旦大学附属中山医院眼科确诊为原发性翼状胬肉并首次行翼状胬肉切除联合自体结膜瓣移植术患者的临床资料,根据术后治疗方案不同分为治疗组(n=25,25眼)与对照组(n=27,27眼),对照组术后采用常规疗法,观察组在对照组基础上采用硅水凝胶绑带式角膜接触镜治疗。比较两组术后1周和1个月的主观症状评分、裂隙灯检查、基础泪液分泌试验、泪膜破裂时间、角膜荧光染色结果。结果术后1周,两组主观症状评分比较差异有统计学意义(P<0.05);术后1个月,两组主观症状评分比较差异无统计学意义。术后1周,治疗组角膜染色阳性率为52.00%(13/25),低于对照组的81.48%(22/27),差异有统计学意义(χ^(2)=3.876,P=0.023)。术后1个月,治疗组角膜染色阳性率为8.00%(2/25),低于对照组的29.63%(8/27),差异有统计学意义(χ^(2)=4.274,P=0.019)。术后1个月,治疗组眼表修复恢复至术前正常水平。结论翼状胬肉切除术后使用硅水凝胶绑带式角膜接触镜可明显改善术后干眼症状,降低角膜染色阳性率,延长泪膜破裂时间,可较快修复翼状胬肉切除术后的角膜上皮,值得临床推广应用。

激光扫描共焦显微镜结合裂隙灯显微镜检查对真菌培养阴性的常见丝状真菌性角膜炎诊断的可行性

目的探讨真菌性角膜炎（FK）主要致病菌——丝状真菌属不同菌种在激光扫描共焦显微镜和裂隙灯显微镜检查下的表现规律，评估其对临床上真菌培养阴性的FK患者进行快速菌种诊断和疗效判断的可行性。方法采用诊断性试验研究方法，于2013年9月至2014年1月在河南省立眼科医院收集993例已经确诊的FK患者，所有患者行角膜病灶真菌培养、角膜激光扫描共焦显微镜和裂隙灯显微镜检查，比较真菌培养不同结果的激光扫描共焦显微镜的FK诊断阳性率以及真菌培养法、角膜激光扫描共焦显微镜检查法发现的菌种分布；总结致病丝状真菌各菌种的裂隙灯显微镜和激光扫描共焦显微镜特征。结果993例FK病例中，真菌培养阳性率为43.20%，激光扫描共焦显微镜检查阳性率为82.07%，激光扫描共焦显微镜诊断阳性率明显高于真菌培养阳性率，差异有统计学意义（χ2＝45.323，P＝0.000）。429例真菌培养阳性病例中，激光扫描共焦显微镜诊断阳性率为92.31%；564例真菌培养阴性病例中，激光扫描共焦显微镜诊断阳性率为74.29%。429例真菌培养阳性病例中，曲霉菌属占比最高，占总检出率的50.12%，其次为镰孢菌属和链格孢菌属，分别占18.18%和10.49%。真菌培养与激光扫描共焦显微镜检查的真菌菌属分布特征一致，二者比较差异均无统计学意义（均P〉0.05）。裂隙灯显微镜和激光扫描共焦显微镜显示的FK患者不同致病真菌特征不同，裂隙灯显微镜下曲霉菌感染灶为羽毛状角膜溃疡，激光扫描共焦显微镜下可见呈高反光、粗细均匀、分枝少的细线状菌丝；裂隙灯显微镜下镰孢菌角膜感染灶呈牙膏样浸润，激光扫描共焦显微镜下可见高反光长棒状、长线状且分枝少的菌丝；裂隙灯显微镜下链格孢菌感染的角膜病灶为角膜白斑，激光扫描共焦显微镜下高反光、粗细不均的长棒状或串珠状、分枝少的菌丝。治疗后激光扫描共焦显微镜下可见菌丝断裂、变短、变细及反光变弱。激光扫描共焦显微镜下FK菌丝应与角膜神经纤维相鉴别，前者呈弥漫分布并相互交织，周围有高反光的炎症细胞，多位于角膜基质层；后者位于上皮下与角膜基质层间，神经纤维直径大于菌丝，周围的细胞结构清晰。结论激光扫描共焦显微镜对丝状真菌感染性FK的诊断阳性率明显高于真菌培养，激光扫描共焦显微镜结合病灶的裂隙灯显微镜下表现可对真菌培养阴性的丝状真菌进行菌种判断并对治疗效果进行动态监测。

2%双醋瑞因滴眼液结膜囊多次与单次给药的角膜药代动力学差异

目的:对比2%双醋瑞因滴眼液结膜囊多次给药与单次给药在角膜中的药代动力学差异,为临床医师治疗感染性角膜病时多次给药提供实验依据。方法:以2%双醋瑞因为实验滴眼液,选取健康无眼疾的雄性昆明白小鼠,随机分为多次给药组和单次给药组,双眼结膜囊分别给予双醋瑞因滴眼液。多次给药组间隔2min给药一次,共给药3次;单次给药组仅给药1次。用高效液相法测定角膜中双醋瑞因的代谢产物(大黄酸)的浓度,多次给药组和单次给药组的时间点均为5、15、30、60、120、180min。将小鼠角膜组织中的药物浓度经药物动力学程序(DAS2.1.1)进行拟合,并计算相关药动学参数。结果:结膜囊多次给药组和单次给药组各个时间点角膜中均可检测到其活性代谢产物大黄酸;多次给药组5、15、30、60、120、180min的浓度分别为318.678±40.88、210.02±25.66、188.83±31.74、112.24±11.70、90.28±22.01和57.67±13.71μg/g,单次给药组各时间点浓度分别为145.17±19.29、97.95±10.49、71.18±18.70、39.11±2.44、18.10±2.34和9.08±2.04μg/g。两组小鼠角膜中大黄酸的含量均于给药后5min最高,多次给药组浓度高于单次给药组浓度,差异具有统计学意义(P<0.01)。随时间延长大黄酸的浓度逐渐下降,3h后多次给药组浓度仍高于单次给药组,差异具有统计学意义(P<0.01)。单次给药组半衰期为0.89±0.31h。结论:结膜囊多次给药与单次给药相比具有药物有效浓度高、维持时间长的优点,双醋瑞因作为一种新的抗菌药物,可以在感染性角膜炎的早期对病程的发展起到抑制作用。多次给药后可以对急性发展期起到较好的治疗效果,而且在夜晚也可维持较高浓度,在保证患者的睡眠休息质量同时又起到了对疾病的治疗作用。

真菌性角膜炎临床常用诊断方法比较分析

目的分析真菌性角膜炎三种常用诊断方法，为早期快速准确诊断提供依据。方法回顾性临床病例研究。对2013年9月至2014年1在河南省眼科研究所就诊的993例真菌性角膜炎患者，均做角膜刮片、真菌培养及共焦显微镜，比较三种检查方法的阳性率，分析性别、年龄及病程对三种诊断阳性率的影响。结果993例真菌性角膜炎患者中角膜刮片阳性率为79．5％（789／993），真菌培养阳性率为43．2％（429／993），共焦显微镜检查阳性率为82．1％（815／993）。角膜刮片与共焦显微镜诊断阳性率差异无统计学意义（P〉0．05），二者较真菌培养诊断阳性率差异有统计学意义（P〈0．05）；在993例患者中男638例，女355例，无论男女角膜刮片与共焦显微镜诊断阳性率差异无统计学意义（P〉0．05），二者较真菌培养诊断阳性率差异有统计学意义（均P〈0．05）；每种诊断方法男女比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；在三种方法诊断阳性者中，年龄均集中在41—70岁，在各年龄段，角膜刮片与共焦显微镜诊断阳性率差异无统计学意义（P〉0．05），二者较真菌培养诊断阳性率差异有统计学意义（P〈0．05）；在各个年龄段内，每种诊断方法差异无统计学意义（P〉0．05）；在993例真菌性角膜炎患者中，最短时间在角膜感染当天即来诊，最长时间在三个月以上。在各个病程来诊的患者，角膜刮片与共焦显微镜诊断阳性率差异无统计学意义（P〉0．05），二者较真菌培养诊断阳性率差异有统计学意义（P〈0．05）。角膜刮片在3个月内的三个时间段，诊断阳性率差异无统计学意义（P〉0．05），较3个月以上诊断阳性率高；真菌培养随着病程的延长，培养阳性率逐渐降低差异有统计学意义（均P〈0．05）；共焦显微镜在各病程差异无统计学意义（均P〉0．05）。结论真菌性角膜炎诊断中，角膜刮片与共焦显微镜诊断阳性率无统计学差异，较真菌培养高。真菌性角膜炎好发病在41—70岁，男性患者较女性多，且性别及年龄均对三种诊断阳性率无影响。角膜刮片在病程大于三个月时诊断阳性率降低，病程对共焦显微镜影响不大，真菌培养随着病程的延长，阳性率逐渐降低。