板栗堆肥理化性质与微生物种类鉴定

为提高资源利用效率,实现栗园的可持续管理,本研究通过对栗园废弃物(栗树枝木屑、落叶、栗花、绿色杂物)分别添加鹿粪和尿素进行好氧堆肥,分析堆肥的理化性质、对堆肥过程中及堆肥结束微生物种类进行分离鉴定,分析堆肥对大豆发芽率的影响。研究发现,添加鹿粪和尿素的堆肥pH值偏碱性且2种堆肥均已充分腐熟,达到应用标准;在2种处理中检测到的微生物分别为35种和39种,其中有益微生物分别有13种和10种,其中共有的微生物为6种,分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、深绿木霉(Trichoderma atroviride),均为有益菌,能够促进植物生长或抵抗病原菌。此外,堆肥浸提液对大豆种子萌发无明显抑制现象,可施用于田间实现资源利用。因此,本研究中尿素及鹿粪堆肥均已达到腐熟,含有多种有益菌,可以施用于田间以提高板栗废弃物的利用,实现栗园的可持续管理。该试验为栗园废弃物堆肥技术的改良和有益微生物的发掘奠定了基础。

大豆菌核病拮抗内生细菌的筛选与鉴定

从北京林业大学校园和海南省儋州植物园共采集6种植物的不同组织,通过五步法表面消毒和选择性分离培养方法共分离得到183株植物内生菌,平板拮抗试验显示,32株内生菌对大豆菌核病病原菌具有拮抗活性,占分离菌株的17.49%;结合抗菌活性、形态特征和宿主来源,选择10株拮抗菌株进行鉴定,结果显示这些菌株分别属于链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Microbacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、无色杆菌属(Achromobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus),具有丰富的微生物多样性。因此,本研究筛选的大豆菌核病病原菌拮抗菌株为开发生物防治混合菌剂提供了菌种资源,为生物防治菌核病、减少农业经济损失奠定了基础。

生防链霉菌SAT1的分离、鉴定及其对辣椒疫霉的生物防治潜力

辣椒疫霉引起的植物病害使农业遭受了巨大的经济损失,环保、经济实用的混合微生物菌剂防治策略是当前的最新发展趋势。试验从6种药用植物分离得到15株植物内生菌,平板拮抗实验筛选得到拮抗链霉菌SAT1,经鉴定为Streptomyces anandii,其发酵液粗提物和挥发性物质对辣椒疫霉菌丝生长有明显抑制作用。接种链霉菌SAT1的孢子液可提高辣椒苗对辣椒疫霉的抗性并明显促进辣椒苗的生长。

内生链霉菌SSD49的抑菌活性和防病促生效果

内生链霉菌SSD49分离自羊角拗的根部,对杨树溃疡病病原真菌具有很强的抑菌活性。为了研究该菌对各种病原菌的抑菌活性,促进植物生长的特征和作为生防菌剂的潜力,进行了平板对峙、组织培养和温室盆栽实验。结果显示,SSD49能够抑制板栗疫病菌、大豆核盘菌、辣椒疫霉、苹果轮纹病病原菌、杨树溃疡病细菌型病原菌、以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和白假丝酵母等多种植物病原菌和人类机会致病菌,并产生几丁质酶和31.56 mg/L的吲哚乙酸;接种SSD49孢子液的毛白杨组培苗、大豆、番茄和辣椒的株高、根长和地上部分干重及根干重分别提高了16.98%-41.82%、19.00%-55.85%、4.58%-70.87%和15.25%-126.06%;对大豆菌核病的防治效果达到88.24%。以上研究结果证明内生链霉菌SSD49在农林业的生物防治中具有潜在的应用价值,生防、促生机理有待进一步深入研究。

耐酸、耐热普鲁兰酶产生菌的筛选及酶学性质研究

利用选择性筛选方案从啤酒厂附近土壤样品中获得两株耐酸、耐热普鲁兰酶产生菌(PPL3和PPLA),16S rRNA基因系统发育分析结果显示,PPL3和PPL4均为芽孢杆菌。酶学性质分析结果显示,最适pH值和最适温度均为7.0和90℃,粗酶液在pH值为5.0和90℃的条件下放置10 h后残余酶活仍分别保持在85%和80%以上,对酸和热表现出很好的稳定性。

利用CRISPR/Cas9系统建立内生链霉菌SAT1的基因簇敲除体系

hyBl(hygB-like)基因簇是内生链霉菌SAT1 中的次级代谢基因簇,经分析它与潮霉素B 基因簇具有52%的相似性,可能在SAT1 抑制栗疫菌(Cryphonectria parasitica)的过程中发挥主要作用。为了深入研究该菌的抑菌机制和hyBl 基因簇的功能,以hyBl 为目标,利用CRISPR/Cas9 技术建立SAT1 的基因簇敲除体系。在实验过程中,通过protospacer 的筛选、敲除载体的构建、接合转移供体菌、Ca2+和Mg2+的选择以及接合时间等多个条件的探索,建立了SAT1 的基因簇敲除体系。最终以E. coli ET12567(pUZ8002/pCRISPomyces2-CB)为供体菌,在MS 培养基(含10 mmol Mg2+)上接合16-18 h,成功获得突变株SAT1△ hyBl(缺失14 kb 的hyBl 基因簇)。突变株对栗疫菌的抑制带宽较野生株降低了77%,这说明该基因簇指导合成的次级代谢产物在抑制栗疫菌方面具有重要的功能。本研究证明了利用CRISPR/Cas9 系统可以对内生链霉菌SAT1 进行基因簇编辑,也为深入研究该菌的抑菌机制、基因工程法验证未知基因簇功能提供了良好的技术支撑。

板栗叶焦枯病相关病菌分离及病因初探

[目的]近年河北板栗主产区大面积严重发生板栗叶焦枯病,造成板栗减产和栗农经济损失,该病害发病原因亟待明确,尽早进行有效的防控。[方法]通过林间症状调查和病叶组织样本微生物分离、离体叶片及盆栽苗接种致病柯赫法则验证,结合果园管理措施和环境因素分析,对病因进行了探讨。[结果]该病栗园病树率可达10%~50%,单株树病叶率可至90%以上,病叶主要症状为叶缘及叶脉间组织干枯。林间、室内湿培及显微镜切片均未发现病组织存在病症或病原菌组织。组织分离纯化获得相关微生物菌株102株,均为真菌,归属10科12属15种,丰度最高为Alternaria alternata。致病性接种试验表明,其中的Ophiognomonia setacea和Coniothyrium pyrinum能引起接种组织局部褐变发病,但症状表现与林间叶焦枯病有差异。[结论]研究发现Ophiognomonia setacea和Coniothyrium pyrinum两种真菌具有致病性,可在中国板栗引发叶斑病,但症状不同于发生于栗园的板栗叶焦枯病。当前频发性树叶焦枯病类病害常见诱发因素,多与气候变暖、异常天气、环境污染以及生产和病虫害管理措施不当引起的品种生长不适应密切关联。河北大面积发生的板栗叶焦枯病病因有待综合非侵染因子进行深入研究和探明,以期为尽快采取有效防控措施奠定基础。

板栗果实内生真菌群落组成及分化特征

[目的]探明果实内生真菌群落结构组成和多样性是了解果实健康微生物组功能和机制的基础。[方法]采用高通量测序技术和传统组织分离方法,对6个板栗品种的健康果实及其果肉(子叶)和果壳(含种皮)组织的内生真菌群落进行了多样性和组成分析。[结果]6个品种的果实及其2个组织共36个样本总共产生3229205条高质量序列,注释出真菌1557个OTUs,分属10个门,38个纲,97个目,203个科,350个属。板栗果实中子囊菌门Ascomycota(平均相对丰度80.40%)丰度最高,其次为担子菌门Basidiomycota(平均相对丰度7.70%),优势纲为粪壳菌纲Sordariomycetes(平均相对丰度43.00%)和酵母纲Saccharomycetes(平均相对丰度15.10%)。品种间共有(Shared)真菌类群富集在座囊菌纲Dothideomycetes上,其丰度>90%。板栗果实品种间,子囊菌门在每一个品种中同样体现为最丰富类群,相对丰度为57.96%~90.15%,其次为担子菌门,相对丰度为3.28%~23.71%;纲水平上,优势类群出现变化,酵母菌纲真菌相对丰度(39.21%)在毛板红品种中是最高的,而粪壳菌纲真菌是另外5个板栗品种中最丰富类群(29.47%~59.56%)。果实组织间,果肉组织较之果壳具有更高的特有真菌多样性,果肉组织特有优势类群全部为担子菌,尤其是银耳纲Tremellomycetes的红菇目Russulales。LEfSe分析显示,果壳和果肉组织存在显著性差异群落组成或种群,镰孢属Fusarium、梅奇酵母属Metschnikowia、迈耶氏酵母属Meyerozyma和德巴利酵母属Debaryomyces真菌在果肉组织中具有显著优势。采用人工培养方法共获得有效菌株2346株,分属子囊菌、担子菌和毛霉菌门Mucoromycota。除酵母菌类需特殊培养基筛选外,可培养方法显示果实及其果壳、果肉上的真菌优势类群,在群落组成和丰度上与高通量测序技术结果相似。[结论]板栗果实具有丰富的以子囊菌粪壳菌纲和酵母菌纲为优势类群的内生真菌群落组成和种群多样性,但建群种类主要来自座囊菌纲。板栗果实品种间的内生真菌群落组成结构具有明显差异。板栗果肉较之果壳组织有更为丰富的特有内生真菌多样性。板栗果肉和果壳组织内生真菌群落组成具有明显分化。本文系统报道了板栗果实内生真菌组的组成结构,为利用板栗健康微生物组防控果实病害和了解坚果类果实微生物组提供了基础。

植物内生链霉菌Streptomyces sp.SAT1的基因组测序和比较基因组分析

【背景】一直以来,链霉菌都是活性物质的主要生产者,近年来随着抗生素滥用引起的环境和微生物抗药性问题越发严重,挖掘高效生物防治因子和新型抗生素成为了解决以上问题的重要手段。【目的】通过获得植物内生链霉菌SAT1全基因组序列和次级代谢基因簇信息,利用比较基因组学和泛基因组学分析SAT1菌株的特殊性以及与其他链霉菌的共性,为阐明SAT1抑菌和内生机制提供理论基础,为揭示链霉菌的生态功能提供可靠数据。【方法】通过三代测序平台PacBio Sequel完成SAT1基因组测序,利用生物信息学技术进行注释和功能基因分类;分别利用RAxML和PGAP软件进行系统发育树的构建和泛基因组分析;次级代谢基因簇的预测和分析通过antiSMASH网站完成。【结果】获得SAT1菌株的全基因组完成图,该菌线性染色体长度约7.47 Mb,包含有4个质粒,GC含量近73%,共预测到7550个蛋白编码基因,含有37个次级代谢基因簇,分属29个类型,其中默诺霉素基因簇与加纳链霉菌具有较高相似性。42株代表链霉菌中,单个菌株次级代谢基因簇数量为20-55个,主要类型为PKS类、Terpene类和Nrps类,而且含有大量杂合基因簇,各个菌株中特有基因数目较为庞大。【结论】链霉菌SAT1菌株在基因组特点以及次级代谢基因簇的数量和类型上与其余41株链霉菌具有一定的共性,其中潮霉素B基因簇和默诺霉素基因簇合成的相关物质可能与SAT1抑菌活性密切相关。42株链霉菌中次级代谢基因簇数量的多少与基因组大小成正相关,同时大量杂合基因簇以及庞大的特有基因数目的存在说明链霉菌在长期进化过程中存在了很高程度的水平基因转移现象,可能具有重要的生态功能。