载体介导的RNA干扰技术抑制肝癌细胞中糖原合成酶激酶3β表达的研究

目的构建和筛选能高效、特异性抑制人GSK-3β基因表达的siRNA表达载体,探讨其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法提取人L02细胞总RNA,RT-PCR扩增GSK-3β基因序列,克隆至pSEB-HUS真核表达载体,构建pSEB-G重组质粒。将设计、合成的3条靶向GSK-3β基因编码区的siRNA及阴性对照分别克隆至pSEB-G,构建siRNA表达载体pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及pSEB-siN-G。将siRNA表达载体瞬时转染HepG2细胞,通过绿色荧光信号、RT-PCR和Western blot观察和检测其对GSK-3β基因的抑制效果,MTT实验和caspase-3活性分析检测其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。结果经双酶切及测序证实,所构建si RNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。瞬时转染HepG2细胞后,其中的pSEB-si1-G能使细胞中绿色荧光信号明显减少,可显著抑制GSK-3βmRNA的表达及蛋白的合成,并使HepG2细胞增殖明显降低,caspase-3活性显著升高。结论成功构建了靶向GSK-3β基因的siRNA表达载体,沉默GSK-3β能显著抑制HepG2细胞的生长并诱导其发生凋亡。

注射用脑蛋白水解物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞增殖与MPP^+诱导的氧化损伤的影响

目的探究注射用脑蛋白水解物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞增殖与1-甲基-4-苯基吡啶(MPP^+)诱导的细胞氧化损伤的影响,为建立评价脑蛋白水解物活力检测方法提供科学依据。方法通过MPP^+损伤PC12细胞后,采用MTT法测定不同厂家、不同浓度的注射用脑蛋白水解物对PC12细胞的修复作用,通过测定其吸光度与正常细胞吸光度的比值来计算样品对PC12细胞损伤的修复率,以此作为注射用脑蛋白水解物活力考察的指标。同时还对注射用脑蛋白水解物对于MPP^+损伤的不同亚型的PC12细胞作用进行了研究。结果注射用脑蛋白水解物作用时间为48 h、浓度为60μg/ml时对MPP^+诱导的PC12细胞的氧化损伤具有较好保护作用,并且对低分化型的PC12细胞具有更明显的保护作用。结论注射用脑蛋白水解物可促进低分化型PC12细胞的增殖,并减轻MPP^+的损伤作用。研究建立的活力测定方法已经被国家标准采纳。

IDO1天然小分子抑制剂的筛选及抗肿瘤作用研究

PCR扩增人吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)基因启动子上游区域1 245 bp基因片段,将其插入到p GL4.20-basic载体中构建了p GL4-IDO1-luc荧光素酶重组质粒。基于双荧光素酶报告基因方法建立IDO1抑制剂筛选模型,筛选能够下调肿瘤细胞中IDO1表达的天然活性小分子化合物。采用MTT、Western blotting和乳酸脱氢酶(LDH)等方法探讨阳性化合物的抗肿瘤作用及其对IDO1的调控机制。化合物川楝素(toosendanin,NS-180)能显著下调IFN-γ诱导的肿瘤细胞中IDO1表达。在A549细胞中,NS-180可抑制STAT1和STAT3的磷酸化,从而下调IFN-γ诱导的IDO1蛋白表达。LDH释放实验表明,NS-180可促进NK细胞对A549细胞的杀伤作用。综上所述,筛选获得的天然小分子NS-180是一类新型高效的IDO1抑制剂,可能成为靶向IDO1的肿瘤免疫治疗候选药物。