简化ALS活性测定方法的可行性探讨

为探讨在离体法测试ALS活性实验中简化提取ALS蛋白步骤和廉价易购的二硫苏糖醇(DTT)替代黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)可行性,以暗培养的玉米幼苗为ALS提取材料,测定了粗蛋白、半精蛋白、精蛋白提取方法提取的ALS蛋白对ALS活性的酶促反应效果;分析了DTT替代FAD辅酶的可行性。试验结果,ALS蛋白提取过程中,可用缓冲液代替液氮碾磨材料,离心速度可降至为10,000 r/min;酶促反应效果粗蛋白酶好于半精蛋白酶、半精蛋白好于精蛋白酶。在离体法测定ALS活性体系中,DTT替代黄素腺嘌呤二核苷酸FAD配制的缓冲液对ALS蛋白的提取及酶促反应效果类似于FAD缓冲液,但由于提取ALS蛋白中携带痕量FAD分子,所以尚未证明在酶促反应中DTT分子完全替代FAD分子起到了ALS辅酶作用。

过氧化氢诱导膜荚黄芪不定根毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累的转录组分析

H2O2处理能显著增加膜荚黄芪不定根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷(CG)的含量。为探究其生物合成机制,以膜荚黄芪不定根为试验材料,经H_(2)O_(2)处理后进行转录组测序筛选差异表达基因。选取上调基因进行功能和代谢通路分析,用qRT-PCR验证,并对相关生理生化指标进行测定。结果表明,差异表达基因的筛选和基因功能注释表明,H_(2)O_(2)处理引起了氧化胁迫,为抵消氧化胁迫,膜荚黄芪不定根通过激活乙烯信号通路,诱导苯丙烷异黄酮生物合成途径中的全部结构基因,从而显著增加CG的含量。此外,为了增加CG,H_(2)O_(2)处理也会诱导苯丙氨酸的生物合成。试验结果进一步揭示了膜荚黄芪不定根中CG的积累机制,为今后规模化生产黄芪CG奠定理论依据。