抗MetFab-DOX对人肝癌细胞的多柔比星耐药作用

目的抗MetFab-DOX能抑制肝细胞肝癌HepG2的增殖,而关于抗MetFab-DOX对多柔比星(DOX)耐药肝癌细胞的作用研究较少。文章构建DOX耐药细胞HepG2/DOX并探讨抗MetFab-DOX对该细胞耐药性的影响。方法使用大剂量间歇诱导法构建DOX耐药肝癌细胞模型HepG2/DOX;细胞分为对照组(不加药物)、DOX组(5μg/m L)、抗MetFab-DOX组(含有DOX浓度5μg/m L),采用CCK8法、流式细胞凋亡检测、细胞免疫荧光、划痕愈合实验以及Transwell侵袭实验检测抗MetFab-DOX对HepG2/DOX增殖、凋亡、药物内化以及生物学功能的影响;构建HepG2/DOX荷瘤裸鼠模型并检测抗MetFabDOX处理后对肿瘤体积和形态的影响。结果耐药细胞株HepG2/DOX细胞对DOX以及抗MetFab-DOX的敏感性均明显降低,HepG2细胞与HepG2/DOX细胞的IC50差异均有统计学意义(P<0.05)。不同药物处理24h后,抗MetFab-DOX组细胞凋亡率高于DOX组(19.87%vs 8.09%,P<0.05);当药物作用48 h时,抗MetFab-DOX组细胞凋亡率亦高于DOX组(41.27%vs16.15%,P<0.01)。抗MetFab-DOX组以及DOX组在30 min细胞内化情况没有明显的差异,而在60 min以及120 min时抗MetFab-DOX组DOX荧光强度高于DOX组。抗MetFab-DOX组24 h细胞划痕愈合率(14.46%)低于DOX组(16.80%)和空白对照组(19.88%),差异有统计学意义(P<0.05)。不同药物处理48 h后,与空白对照组细胞划痕愈合率(56.43%)和DOX组(36.96%)相比,抗MetFab-DOX处理后显著下降(22.60%),差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组单个视野平均穿膜细胞数(1043.52个)比较,DOX组(880.51个)和抗MetFab-DOX组(646.18个)明显减少(P<0.05),且抗MetFab-DOX组明显低于DOX组(P<0.05)。药物处理第40天时,抗MetFab-DOX组抑瘤率明显高于DOX组(64.00%vs 35.27%,P<0.05)。对照组中移植瘤组织细胞排列不规则,增殖期肿瘤大小不一,数目占比大。DOX组与对照组相比,细胞增生略有下降。在抗MetFabDOX组中,肿瘤细胞进一步出现明显的皱缩变小,肿瘤细胞数量减少。结论抗MetFab-DOX能有效降低肝细胞肝癌对DOX的耐药性,其机制可能与抗MetFab-DOX能够增加药物细胞中的积聚,诱导细胞凋亡相关。

Trop2对胃癌细胞耐药性的影响及机制研究

目的:探讨滋养层细胞表面抗原2(Trop2)对胃癌细胞化疗耐药的影响及机制。方法:应用慢病毒转染技术将Trop2 sh RNA转染至BGC823细胞株,通过嘌呤霉素筛选出稳定转染质粒的细胞株;q RT-PCR、Western blot和免疫荧光方法检测质粒干扰效率;CCK-8细胞增殖试验和流式细胞术检测柔红霉素对BGC823细胞株增殖能力和细胞凋亡的影响;q RT-PCR、Western blot检测耐药相关基因TopoⅡα的m RNA和蛋白表达变化。结果:在稳定转染Trop2 sh RNA质粒的sh Trop2组中,Trop2 m RNA及蛋白表达水平较对照组(未处理)和sh NC组(转染空载体质粒)明显下调;在相同药物浓度下,柔红霉素对shTrop2组的增殖抑制率明显高于对照组和sh NC组,sh Trop2组半数抑制浓度低于对照组和sh NC组(P<0.05),sh Trop2组中柔红霉素诱导的细胞凋亡率显著高于对照组和sh NC组(P<0.05);稳定干扰Trop2表达后耐药相关基因TopoⅡα的表达显著上调。结论:Trop2通过抑制TopoⅡα的表达,可增强胃癌细胞对柔红霉素的耐药性。

老年肺炎患者的抗菌抗体和T细胞反应与肺细菌定植和肺功能的关系

目的 探讨老年肺炎患者的抗菌抗体和T细胞反应与肺细菌定植和肺功能的关系。方法 回顾性选择2019年6月至2021年4月在南京医科大学第一附属医院老年科因肺炎住院治疗的73例老年患者作为老年肺炎组,30名同期无肺炎或肺部感染等疾病的健康体检人员作为对照组。根据电子档案记录对参与人员的一般资料进行统计。使用酶联免疫吸附试验方法检测血清细菌抗体水平。通过ELIspot测量T细胞微生物抗原的反应。使用流式细胞术分析细菌抗原刺激产生的CD4^(+)CD69^(+)T细胞比率。通过肺活量测定以确定1 s内用力呼气量(FEV1)和用力肺活量(FVC),计算FEV1%预测值。分析T细胞反应和肺功能FEV1%的相关性。结果 (1)老年肺炎组抗铜绿假单胞菌抗体、抗流感嗜血杆菌抗体和抗嗜麦芽窄食单胞菌抗体水平较对照组升高,抗肺炎链球菌抗体较对照组降低,差异均有统计学意义(P <0.05)。(2)老年肺炎组对铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和嗜麦芽窄食单胞菌刺激产生的γ干扰素(IFNγ)斑点形成细胞数量较对照组减少,差异均有统计学意义(P <0.05)。(3)不同抗原刺激下老年肺炎组与对照组活化CD4^(+)CD69^(+)T细胞比较差异无统计学意义(P> 0.05),2种细菌抗原刺激后两组PBMC中CD4^(+)CD69^(+)T细胞比率均显著高于未刺激PBMC,流感嗜血杆菌刺激后该比率也显著高于铜绿假单胞菌刺激差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)细菌当前定植患者较无定植、偶尔定植和以前定植的患者肺功能指标FEV1%显著降低,差异均有统计学意义(P <0.05),而当细菌定植变得更加频繁且当前培养呈阳性时,老年患者的肺功能呈显著下降趋势。(5) T细胞反应和肺功能FEV1%呈正相关(r=0.501,P=0.033)。结论 肺炎老年患者肺细菌定值会产生抗体反应,其抗体反应水平与暴露水平、肺功能降低的水平呈正比;另外,T细胞反应在感染率增加的患者中降低,并且与流感嗜血杆菌的肺功能呈正比,因此推测其均可能与肺炎患者疾病进展或肺功能改善密切相关。

潜伏膜蛋白2A嵌合抗原受体-T细胞的制备及对鼻咽癌细胞杀伤作用的研究

目的制备靶向潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein2A,LMP2A)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞,观察LMP2ACAR-T细胞体内外对鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法2016年9月至2017年12月,本研究以基因工程技术构建抗LMP2A慢病毒表达载体,测序鉴定并通过Western blot法验证抗LMP2ACAR在293T细胞中的表达;通过质粒包装体系制备LMP2ACAR慢病毒,并感染人T细胞,制备LMP2ACAR-T细胞;CCK-8法检测LMP2ACAR-T细胞对鼻咽癌细胞的杀伤作用。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测LMP2A抗原激活后的LMP2ACAR-T细胞白细胞介素(IL)-2与干扰素(IFN)-γ的分泌水平。体内实验观察LMP2ACAR-T细胞对鼻咽癌移植瘤的抑瘤作用。SPSS21.0统计学软件用于统计分析。结果PCR结果显示抗LMP2ACAR片段大小约为1500bp,与理论值相一致,测序显示序列正确;Westernblot结果显示抗LMP2A慢病毒表达载体能在293T细胞中表达;CCK-8法结果发现在效靶比为20∶1、10∶1与5∶1时,LMP2ACAR-T细胞对LV-LMP2A-CNE1细胞的杀伤率分别为(72.11±9.75)%、(54.65±5.42)%与(36.68±3.80)%,与CD19CAR-T细胞、T细胞相比差异有统计学意义(P<0.05),而对CNE1细胞的杀伤作用与CD19CAR-T细胞和T细胞相比差异无统计学意义;ELISA法结果发现LMP2ACAR-T细胞与LV-LMP2A-CNE1细胞共培养上清中IL-2与IFN-γ的含量,显著高于与CNE1细胞共培养上清,差异具有统计学意义(P<0.05);体内实验中LMP2ACAR-T细胞组瘤体体积为(80.3±10.0)mm3,显著小于各对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功制备的LMP2ACAR-T细胞对LMP2A阳性的鼻咽癌细胞具有显著靶向杀伤效应。

靶向c-Met嵌合抗原受体T细胞的制备及其对鼻咽癌细胞作用的研究

目的构建靶向c-Met的嵌合抗原受体(CAR)逆转录病毒载体,制备靶向c-Met CAR-T,观察其对c-Met阳性鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法利用基因工程技术构建抗c-Met scFv,并将其重组到含有CD28,CD137,CD3ζ等的逆转录病毒载体中,形成c-Met CAR逆转录病毒载体,测序确认。以该病毒载体感染T淋巴细胞,通过Western blotting检测c-Met CAR在T淋巴细胞中的表达。CCK-8检测c-Met CAR-T对鼻咽癌细胞的作用;通过ELISA检测c-Met CAR-T作用后IFN-γ、IL-2的变化。结果测序结果显示c-Met CAR病毒载体序列正确;Western blotting可检测到CD3ζ的表达;CCK-8结果显示,c-Met CAR-T明显抑制c-Met阳性的鼻咽癌细胞的增殖(P<0.05);ELISA结果显示,c-Met CAR-T作用后分泌IFN-γ、IL-2明显增加(P<0.01)。结论成功制备了靶向c-Met的嵌合抗原受体逆转录病毒载体。该嵌合抗原受体能在T细胞中表达,能有效抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞增殖,增加IFN-γ、IL-2的分泌。