少棘蜈蚣抗菌肽scolopin 2的克隆、表达与抗癌机制研究

旨在研究AMP-scolopin 2的抗菌活性和抗癌机理。利用SUMO融合技术对AMP-scolopin 2进行了体外表达;采用抑菌圈、MTT、流式细胞术和Western blotting等技术分析了其抗菌活性、溶血活性和对肿瘤细胞的促凋亡作用。结果表明,成功表达并纯化了AMP-scolopin 2;AMP-scolopin 2对白血病细胞(K562)和肝细胞癌(Hep G2)具有抑制增殖和促凋亡作用,但对红细胞和正常细胞HEK293的影响很小;AMP-scolopin 2(40μmol/L)可以诱导K562(21.4%)和Hep G2(18.5%)细胞凋亡;此外,AMP-scolopin 2下调了与线粒体相关的凋亡蛋白pro-caspase-3、pro-caspase-9和pro-PARP的表达,且呈浓度依赖性。AMP-scolopin2可以通过线粒体caspase依赖性途径促进肿瘤细胞凋亡。

鲸类二次水生生境适应Epac1和Epac2基因的分子进化

心率即心脏跳动的速度,不仅反映心脏的功能,还与寿命的长短及能量代谢有关。与大多数陆生哺乳动物相比,鲸类心率显著降低。降低的心率有助于鲸类寿命的延长及能量的高效利用,便于其适应极端的海洋环境,而这一适应的分子机制尚不清楚。鉴于此,本研究采用基于最大似然法的枝模型、枝位点模型结合蛋白质功能差异分析等方法,对控制心率的环腺苷酸结合蛋白(Epac1和Epac2)基因进行适应性探究。分析结果表明,Epac1在长寿鲸类即须鲸类和抹香鲸(Physeter macrocephalus)组合进化支中检测到加速进化过程,且枝位点模型在须鲸类祖先支中检测到的强烈的正选择位点均位于功能重要的催化区;另外,该蛋白质在鲸类中还发生了显著的功能修饰(θ=0. 529 6±0. 130 0; P <0. 001)。对Epac2进行相同的分析发现,该基因在寿命长达200年之久的弓头鲸(Balaena mysticetus)中检测到的正选择位点同样位于功能重要的催化区。上述结果提示Epac1和Epac2在鲸类中均产生了适应性进化,这一方面可能有助于鲸类心率降低,另一方面也可能与其较长的寿命及高效的能量利用有关。

瓶鼻海豚(Tursiops truncatus)及其近缘物种牛(Bos taurus)TLR 8基因免疫应答功能的探究

鲸类是陆生哺乳动物的后代,大约在5600万年前从陆地过渡到海洋,鲸类自身免疫机能为了应对海洋病原体的挑战发生了适应进化.TLR 8基因属于病毒型Toll样受体家族成员,被病原体诱导后激活下游信号通路,在调节机体抵抗病原体感染的免疫方面发挥着重要作用.本研究分析了瓶鼻海豚(Tursiops truncatus)及其近缘陆生物种牛(Bos taurus)的TLR 8基因的结构,克隆了TLR 8基因并构建重组质粒转染人胚肾细胞系HEK293细胞,再用TLR 8人工合成激动剂R848刺激该细胞,检测TLR 8信号通路下游基因NF-κB和IL-8的表达差异.实验结果表明,两个物种的NF-κB和IL-8表达量均显著高于空载体转染组,而瓶鼻海豚的表达量又均低于牛.由此推测,在应对异源刺激时TLR 8基因发挥了免疫功能,为了适应不同于陆地环境的海洋环境,鲸类采取了和陆生哺乳动物不同的应对策略和模式.

长江江豚TRAIL基因的克隆、体外表达及生物学功能分析

构建可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的表达体系,研究其蛋白表达产物对肿瘤细胞凋亡的影响,为以后江豚免疫系统的研究奠定基础。通过RT-PCR技术从江豚Neophocaena phoconoides血液总RNA中反转录扩增出肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(简称fTRAIL)的全长cDNA序列,并将fTRAIL的胞外可溶性(简称fsTRAIL)片段连接入表达载体pET43.1a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化,Western blotting对产物Nus-His-fsTRAIL蛋白进行鉴定。体外用MTT法、台盼蓝拒染法及流式细胞术检测Nus-His-fs TRAIL蛋白对Jurkat细胞和HeLa细胞的影响。成功构建了fTRAIL胞外可溶性片段(简称fsTRAIL)与pET43.1a组成的表达载体,并获得Nus-His-fsTRAIL蛋白。体外实验表明,Nus-His-fsTRAIL蛋白能够以剂量依赖的方式抑制Jurkat和HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡。Nus-His-fsTRAIL表达产物具有对Jurkat和HeLa细胞体外抗肿瘤活性的作用。