利用CRISPRi挖掘大肠杆菌生物合成D-泛酸的关键基因

【目的】D-泛酸(D-pantothenic acid,DPA)是一种重要的功能化合物,被广泛应用于医疗保健、化妆品、动物食品和饲料等领域,具有良好的市场前景及应用。本研究以实验室保藏的大肠杆菌菌株DPAP10为底盘菌株,利用CRISPR干扰(clustered regularly interspaced palindromic repeats interference,CRISPRi)技术,筛选影响工程菌株DPA生物合成的内源性基因靶点。【方法】构建了pTarget和pdCas9的双质粒CRISPRi系统,可以实现对基因单个或组合表达抑制,摇瓶发酵检测基因抑制对DPA合成的影响;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测了基因抑制后的转录水平;通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测了中间代谢物分析代谢通路变化。【结果】成功从126个靶基因中筛选得到5个显著影响DPA合成的关键基因pgk、gltA、ptsH、ptsI、crp和7个基因组合pgk-gltA、pgk-ptsH、gltA-ptsH、pgk-ptsI、gltA-ptsI、pgk-crp、gltA-crp,其中菌株DPAP10/pdCas9+pT-gltA-ptsH相对于原始菌株DPAP10,在摇瓶中DPA产量提高了49.5%达到5.3 g/L,进一步在基因组上对gltA和ptsH的表达进行下调,得到工程菌株DPAP10-gltATTG-ptsHTTG,最终在5 L罐中DPA产量相较于对照菌株DPAP10在相同培养条件下提高了19.5%达到75.4 g/L。【结论】本研究证实CRISPRi筛选可以得到对DPA合成有益的基因靶点;中间代谢物检测分析发现,改变丙酮酸通量分布和降低三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环速率,会导致碳流更多流向DPA合成代谢路径中,从而提高DPA的产量,这一发现为构建更高产菌株提供了新思路。